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36只实验用大白兔随机进入实验组，实验组分为 A、 B、 C三组， A组为腰椎皮下埋植原料药， 结果 利福平在0.01-5.0μg/mL的肝脏浓度范围内线性关系良好(r=0.9999)，回收率达85%以上，日内变异系数均小于10%；利福平在0.05-10.0μ g/ mL 的肺脏部位和脾脏部位浓度范围内线性关系良好(前者 r=0.9999，对于血浆中利福平的浓度基本检测不到，腰大肌和腰椎体都有利福平的蓄积。结论本研究建立了一种兔子肝脏、肺脏和脾脏组织中利福平简便、快速、灵敏准确的高效液相色谱（ HPLC）检测方法，并将该方法应用在利福平在家兔体内的药物动力学研究。
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关键词 利福平 兔肝脏 兔肺脏 兔脾脏 高效液相色谱法 3
结核病是目前感染性疾病中的一号杀手，1992 年世界卫生组织正式结核病进入了“全球紧急状态”[1]。现关于结核病方面的已成为全球性的严峻难题，我国是这一方面的重灾区，仅次于印度。随着人们生活水平的提高，对自身健康的关注也随之提高。世界各国结核病的发病率和死亡率曾因卫生状况的改善和抗结核病药物的不断发展大幅度的下降。但是，由于耐药问题方面的突出，艾滋病的流行使其与结核分枝杆菌的双重感染，再加上有些贫困地区人口的剧增等诸多方面的原因，使得结核病疫情再度恶化，控制方面变得更难。
自从 1944 年链霉素被发现以来，异烟肼、利福平等抗结核药物相继问世。根据其抗菌能力强弱，可将现今的抗结核药物依次分为：：环丝氨酸（CS）、乙胺丁醇（EMB）、对氨基水杨酸（PAS）；②具备杀菌作用的抗结核药物：利福平（利福平）、异烟肼（INH）、吡嗪酰胺（PZA）、卷曲霉素（KM）、卡拉霉素（CPM）、链霉素（SM）；具备一定杀菌能力的抗结核药物：。临床上将利福平、异烟肼、链霉素等定义为一线抗痨药。剩余的皆为二线抗痨药。1978 年的全国结核病会议上，提出了 37
抗结核药物的开发过程十分漫长，从被发现到应用于临床一般需要 10 年左右的时间，花费将近 10 亿美元。据统计，在利福平问世之后的 30 年间，被批准上市的新药有 1200 多种，但这其中没有一种用于抗结核的药物。一部分原因是因为抗结核药物开发起来较其他抗生素相对困难，另一部分原因是因为结核病大都发生在发展中国家和贫困国家，制药工业的积极性不足与临床需要不成比例是其重要原因之一。。传统的抗结核药物（如利福平）的给药方式存在以下缺点：①给药时间长，现有的抗结核治疗方案均为长期型，时间要求均要 6-9 个月以上，部分治疗方案则要求 12-18 个月以上；②药物在体内的作用时间短，需经常服药，在病灶内能否达到有效的杀菌抑菌浓度还存在争议； ④治疗周期长，病人依从性差，易产生耐药性。二十世纪八十年代以来，科学家们对抗结核药物的载体以及缓释技术的研究从未停止，有望弥补以上的不足。[6] 38
肝脏毒性是利福平的主要不良反应，利福平和异烟肼合用还会明显增加肝毒性，甚至出现致命的急性肝坏死和肝功能衰竭。已有研究资料表明，利福平易导致发生变态反应，可致黄疸和肝细胞坏死，还可直接引起脂质过氧化致肝脏损伤，并且作为肝微粒体酶的诱导剂，其与异烟肼联合应用时可刺激微粒体酶加速乙酰肼合成，从而使肝损伤加重，但目前还缺乏利福平毒性作用机制的深入研究。[7] 39
利福平的分析方法的研究，改进也是必不可少的。综合文献，利福平的分析方法也有很多，如分光光度法，化学发光法，高效液相色谱法等。在大部分文献报道中，利福平的高效液相色谱方法含量测定技术已经较为成熟。并建立快速、简便、灵敏准确的高效液相色谱检测方法。
乙腈(色谱纯)，杭州市米克化工仪器有限公司；甲醇(色谱纯)，杭州市米克化工仪器有限公司；磷酸二氢钾(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；乙酸乙酯(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸(分析纯)，杭州高晶精细化工有限公司；二氯甲烷(分析纯)，杭州高晶精细化工有限公司；正己烷(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；水(本实验用到的水均为超纯水)； 利福平标准品(中国药品生物制品检定所)； shimadzu 20AT 高效液相色谱系统(日本岛津)； 浙江大学智达 N2000 色谱工作站； YKH-型涡旋混合器(上海精科实业有限公司)； KQ-25OB 型超声波仪(昆山超声仪器有限公司)；氮吹仪(上海极恒实业有限公司)；；抽滤装置(上海富雪生物科技有限公司)；；0.45μm 微孔滤膜(上海新亚净化器件厂)；
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10ml 具塞离心管，1.5ml 小离心管，尖底玻璃离心管； 实验用大白兔(由浙江省实验动物中心提供)，体重 2.2kg~2.5kg/只，雌雄兼用。
取实验用大白兔 46 只，体重 2.2-2.5kg/只，雌雄不限，分笼饲养。随机取 1 只用于空白方法组，其余 45 只随机进入实验组。实验组共分为 A、B、C 三组，每组 15 只。，用速眠新麻醉 0.5 ml/ kg+氯胺酮 0.1 ml/ kg 麻醉，等麻醉起效后，：定期观察动物活动及进食情况，伤口愈合情况 ②准确吸取上述 0.6 ml 肝脏组织匀浆液于 10 ml 具塞离心管中，振荡混匀，后向其中准确加入乙酸乙酯 3 ml，涡旋振荡器漩涡 5 min，在 6000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中；向萃取完第一次后的 10ml 具塞离心管中加入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。后合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中，在45℃水浴中用氮气流吹干装有有机相的尖底玻璃离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残渣用 0.2 ml 流动相复溶，涡旋振荡器漩涡混匀 1 min，再将其放入试管架中，将此带有处理过的尖底玻璃离心管放入超声仪中超声 15 min，使尖底玻璃离心管中的残渣与流动相充分混匀。后将其移入 1.5 ml 的小离心管中，后在其加入 0.2 ml 正己烷取出脂肪，于涡旋振荡器漩涡 1 min，将小离心管置于离心机，在 18000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，吸取上清液 20μ l进高效液相色谱系统分析。
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②准确吸取上述 0.6 ml 肺脏组织匀浆液于 10 ml 具塞离心管中，振荡混匀，后向其中准确加入乙酸乙酯 3 ml，涡旋振荡器漩涡 5 min，在 6000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中；向萃取完第一次后的 10ml 具塞离心管中加入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。后合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中，在45℃水浴中用氮气流吹干装有有机相的尖底玻璃离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残渣用 0.2 ml 流动相复溶，涡旋振荡器漩涡混匀 1 min，再将其放入试管架中，将此带有处理过的尖底玻璃离心管放入超声仪中超声 15 min，使尖底玻璃离心管中的残渣与流动相充分混匀。后将其移入 1.5 ml 的小离心管中，后在其加入 0.2 ml 正己烷取出脂肪，于涡旋振荡器漩涡 1 min，将小离心管置于离心机，在 18000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，吸取上清液 20μ l进高效液相色谱系统分析。
②准确吸取上述 0.6 ml 脾脏组织匀浆液于 10 ml 具塞离心管中，振荡混匀，后向其中准确加入乙酸乙酯 3 ml，涡旋振荡器漩涡 5 min，在 6000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，取出全部上层有机相于尖底玻璃离心管中；向萃取完第一次后的 10ml 具塞离心管中加入 2ml 乙酸乙酯重复萃取一次。后合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中，在45℃水浴中用氮气流吹干装有有机相的尖底玻璃离心管。后留在尖底玻璃离心管中的残渣用 0.2 ml 流动相复溶，涡旋振荡器漩涡混匀 1 min，再将其放入试管架中，将此带有处理过的尖底玻璃离心管放入超声仪中超声 15 min，使尖底玻璃离心管中的残渣与流动相充分混匀。后将其移入 1.5 ml 的小离心管中，后在其加入 0.2 ml 正己烷取出脂肪，于涡旋振荡器漩涡 1 min，将小离心管置于离心机，在 18000 r/ min 转速的条件下高速离心 5 min 后，吸取上清液 20μ l进高效液相色谱系统分析。
将得到的上述两种上清液样品经过高效液相色谱进行分析，以流动相为乙腈- 4（v/v），每次进样 20μl 为准，设置流速为 1.0ml/min，紫外检测波长为 333nm，柱温为 35℃。
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2.2.2.5 0.01mol/L 磷酸二氢钾溶液与 1mol/L 柠檬酸溶液的制备 ：称取 0.20g 的磷酸二氢钾，加入 150ml 的超纯水于 250ml 烧杯中搅拌均匀即可。
：称取 10.51g 的柠檬酸，加入 50ml 的超纯水于 100ml 烧杯中搅拌均匀即可。
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将上述配制好的 150 ml 的 0.01 mol/ L 磷酸二氢钾溶液中取 130 ml 和 50 ml 的 1 mol/ L 柠檬酸溶液中取 20 ml，加入 150 ml 甲醇和 200 ml 乙腈混匀即可，然后进行抽滤，超声振荡 15 分钟。
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2.2. 准确称取利福平标准品溶解于色谱甲醇中，作为储备液，利用流动相将储备液分别稀释成 100.0，，取 6 支具塞离心管中准确加入 0.6 mL 空白肝脏组织匀浆液，再向上述每个离心管中各加入 60μ L 上述标准液，”处理后进样分析，以利福平药物峰面积（Y）为纵坐标，以质量浓度（X）为横坐标作标准曲线，求出标准曲线方程和相关系数（r）。
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2.2.3.2 兔肺脏组织标准曲线的制备 77
准确称取利福平标准品溶解于色谱甲醇中，作为储备液，利用流动相将储备液分别稀释成 100.0，，取 6 支具塞离心管中准确加入 0.6 mL 肺脏组织匀浆液，再向上述每个离心管中各加入 60μ L 上述标准液，”处理后进样分析，以利福平药物峰面积（Y）为纵坐标，以质量浓度（X）为横坐标作标准曲线，求出标准曲线方程和相关系数（r）。
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2.2.3.3 兔脾脏组织标准曲线的制备 79
准确称取利福平标准品溶解于色谱甲醇中，作为储备液，利用流动相将储备液分别稀释成 100.0，，取 6 支具塞离心管中准确加入 0.6 mL 空白脾脏组织匀浆液，再向上述每个离心管中各加入 60μ L 上述标准液，”处理后进样分析，以利福平药物峰面积（Y）为纵坐标，以质量浓度（X）为横坐标作标准曲线，求出标准曲线方程和相关系数（r）。
2.2.4.1 兔肝脏中利福平的回收率及精密度 82
按上述兔肝脏的方法制备含利福平高、中、低浓度质控样品（含利福平分别为 0.05，0.5，5μ g/ ml），按照上述方法处理后进样分析，每个浓度重复 5 次，以样品中药物与直接溶于流动相下峰面积比值，计算高、中、低 3 种浓度下提取回收率。比较以上样品于日内 5 次和日间 5 次测定的峰面积变化，计算日内和日间精密度。
2.2.4.2 兔肺脏中利福平的回收率及精密度 84
按上述兔肺脏的方法制备含利福平高、中、低浓度质控样品（含利福平分别为 0.05，0.5，5μ g/ ml），按照上述方法处理后进样分析，每个浓度重复 5 次，以样品中药物与直接溶于流动相下峰面积比值，计算高、中、低 3 种浓度下提取回收率。比较以上样品于日内 5 次和日间 5 次测定的峰面积变化，计算日内和日间精密度。
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2.2.4.3 兔脾脏中利福平的回收率及精密度 86
按上述兔脾脏的方法制备含利福平高、中、低浓度质控样品（含利福平分别为 0.05，0.5，5μ g/ ml），按照上述方法处理后进样分析，每个浓度重复 5 次，以样品中药物与直接溶于流动相下峰面积比值，计算高、中、低 3 种浓度下提取回收率。比较以上样品于日内 5 次和日间 5 次测定的峰面积变化，计算日内和日间精密度。
所有动物手术顺利，术中平稳，伤口愈合良好无感染。
以浓度范围为横坐标，峰面积为纵坐标作图如下图 92
3.2.1 兔肝脏组织浓度标准曲线的制备 93
在本试验提取方法和色谱条件下，在 0.01-5.0 μg/mL 浓度范围，线性关系良好，利用线性回归方法计算出斜率、截距以及相关系数。
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兔肝脏组织浓度标准曲线 95
3.2.2 兔脾脏组织的标准曲线制备 96
在本试验提取方法和色谱条件下，在 0.05-10.0 μg/mL 浓度范围，线性关系良好，利用线性回归方法计算出斜率、截距以及相关系数。
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兔脾脏组织浓度标准曲线 98
3.2.3 兔肺脏组织的标准曲线制备 99
在本试验提取方法和色谱条件下，在 0.05-10.0 μg/mL 浓度范围，线性关系良好，利用线性回归方法计算出斜率、截距以及相关系数。兔肺脏组织浓度标准曲线 102
3.3.1 兔肝脏组织中利福平的回收率和精密度 103
在给定的提取方法和检测条件下，利福平在肝脏组织中的回收率平均达 90%以上，日内变异系数均小于 10%，说明该药物在兔子血浆中回收率较好，精密度符合检测标准（结果见表 1）。
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添加浓度（μg·ml-1）回收率 (%)变异系数（％）
表 1.兔肝脏组织中利福平的回收率和精密度 110
3.2.2 兔肺脏组织中利福平的回收率和精密度 111
在给定的提取方法和检测条件下，利福平在肌肉组织中的回收率达 88%以上，日内日间变异系数均小于 10%，说明该药物在兔子肌肉组织中回收率较好，精密度符合检测标准（结果见表 2）。
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添加浓度（μg·ml-1）回收率 (%)变异系数（％）
表 2.兔肺脏组织中利福平的回收率和精密度 118
3.2.3 兔脾脏组织中利福平的回收率和精密度 119
在给定的提取方法和检测条件下，利福平在椎骨组织中的回收率达 85%以上，日内日间变异系数均小于 10%，说明该药物在兔子椎骨组织中回收率较好，精密度符合检测标准（结果见表 3）。
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添加浓度（μg·ml-1）回收率 (%)变异系数（％）
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表 3.兔脾脏组织中利福平的回收率和精密度 126
3.3 利福平在肝脏、肺脏及脾脏组织中的浓度 127
3.3.1 兔肝脏组织中利福平的浓度 3.3.2 兔肺脏组织中利福平的浓度 3.3.3 兔脾脏组织中利福平的浓度 132
4.1 利福平在肝脏、肺脏及脾脏中的浓度 。可能因利福平容易在胃肠道吸收，之后迅速进入肝肠循环，在许多器官和组织中达到有效浓度。
说明兔子腰椎皮下埋植这种给药方式利福平的释放符合双相药物动力学释药规律，即早期为快速释药相，后期为缓释相，这种释药特点可以使局部形成有效浓度并有效持续下...