下面是小编为大家整理的分子标记特点和应用（完整文档）,供大家参考。
分子标记技术方法和他们特点 1、限制性片段长度多态性标记分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLP
RFLP 技术的是检测 DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段 DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生 RFLP 技术特点：
RFLP 技术优点：
①结果稳定，重复性好，特殊是 PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，牢靠性更高。
②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、进展阶段及组织部位影响。
③RFLP 标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。
④核基因组的 RFLP 标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的 RFLP 一般表现为母性遗传。
RFLP 技术缺点：
①分析所需 DNA 量较大，分析速度慢。
②步骤较多，周期长，技术简单，费用高。
③检测多态性水平过分依靠限制性内切酶，使多态性降低，对 DNA 质量要求高。
④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。
⑤对于线粒体 DNA 而言，由于其进化速度快，影响种以上水平的 RFLP 分析的精确
性。但是种以上水平影响很小。
2.随机扩增多态性 DNA 技术（Random Amplified Polymorphism DNA）— RAPD 以单一的随机引物(一般为10个碱基)采用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的 DNA 片段长度变异。它是采用随机引物通过 PCR 反应非定点扩增 DNA 片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物 DNA 片段的多态性。
D RAPD 技术 特点 ：
RAPD 优点：
①无种属特异性,一套 RAPD 引物可以应用于任意一种生物的讨论，具有广泛和通用的特点。
②适合于自动化分析。操作技术简洁，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。
③不需制备探针、杂交等程序，引物价格低，成本较低。
④.DNA 用量少，允许快速、简洁地分别基因组 DNA。
⑤不受环境、发育、数量性状遗传等影响，能够客观地提示供应材料之间 DNA 的差异。
RAPD 缺点：
①是一种显性标记，用于二倍体生物时，区分纯合子和杂合子的困难性会引入统计分析。
②.稳定性较差，在某些状况下，试验结果不能重复，结果牢靠性低。
③该技术的使用因生物种类而定。在细菌中，其因是单倍体，又是无性繁殖，所以 RAPD 标记技术很有用。
3 任意引物.PCR 标记技术（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction）-AP—PCR
AP—PCR 分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ， PCR 反应分为两个阶段，首先寡核
昔酸引物在低严谨条件下与模板 DNA 退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延长可连续在高严谨条件下扩增。采纳变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析 PCR 产物，最终反应结果与 RAPD 类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能削减引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的 AP—PC R 谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50 个引物能产生 1250 种不同指纹图谱。
AP — PCR 特点：
AP—PCR 优点：AP—PCR 方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。它产物的多态性遵循孟德尔定律，其方法快速、经济、简便。
AP—PCR 缺点：
是每个新的多态性都必需经纯化才能进一步使用。此外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。
4.短串联重复序列（ simple tandem repeats）
— STR
又 称 为 简 洁 重 复 序 列 （ simple sequence repeats,SSR ）， 也 称 微 卫 星 标 记（microsatellite），是匀称分布于真核生物基因组中的简洁重复序列。其串联重复的核心序列为1-6bp，最常见是双核苷酸重复，即(CA)n 和(TG)n。微卫星 DNA 的高度多态性主要来源于串联数目的不同。由于重复单位的重复次数在个体间,呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用特别广泛。
R STR 特点：
① 序列简洁, 重复基元为1-5bp, 但是具有很多不同组合方式。标记为点专化性，一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。
② 高度重复多拷贝, 从几十到几百乃至千万拷贝数。
③ 重复片段长度具有多态性, 在染色体重复区域的位置不同其重复单元数量有差异。在不同品种之间的基因组对等位点具有多态性。
④ 散状分布, 大多数SSR 以随机方式存在于单拷贝或寡拷贝基因间, 旁侧与编码基因相连接, 因此可以用于标记旁侧编码基因( 掌握各种性状的结构基因) , 此类重复片段一般较长。还有一些SSR 存在于基因内。因此可用于评价等位基因的遗传多样性, 可杂种鉴定、种质资源讨论。
⑤ 共显性分子标记, 等位的DNA 区段多态性易保留在基因组内, 由于大多数SSR 是不编码的, 因此在该区域内的突变为中性突变, 不易被自然选择和人工选择而淘汰。能稳定地存在于基因组内。
⑥ SSR 标记一般基于PCR 技术, 其多态性能经过扩增呈现出来。技术易撑握可一般的分子生物学试验室进行。
5、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism)— SNP
核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism) 是基于 DNA 芯片技术的第三代 DNA遗传标记技术。SNP 是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可关心区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1250 bp SNP 消失一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学讨论具有重要意义 SNP P 特点：
①密度高：SNP 在人类基因组的平均密度估量为1ö1000 bp , 在整个基因组的分布达3 ×106 个, 遗传距离为2--3cM , 密度比微卫星标记更高, 可以在任何一个待讨论基因的内部或四周供应一系列标记。
②富有代表性：某些位于基因内部的 SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。
③遗传稳定性：与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。
④易实现分析的自动化：SNP 标记在人群中只有两种等位型(allele), 故也称为双等位标记(biallelic marker)。这样在检测时只需一个" +/- " 或" 全/无" 的方式, 而无须象检测限制性片段长度多态性, 微卫星那样对片段的长度作出测量, 这使得基于 SNP 的检测分析方法易实现自动化。
⑤数量多，分布广，在单个基因和整个基因组中分布不匀称，绝大多数在非编码区。与串联重复的微卫星位点相比，SNP 是高度稳定的，尤其是出于编码区的 SCP（cSCP），而前者的高突变率简洁引起对生物群的遗传分析消失问题。
6、扩增片段长度多态性标记技术(Amplified Fragment Length Polymorphism)— AFLP
以 PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了 RFLP、RAPD 的分子标记技术。把 DNA 进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行 PCR 扩增(在全部的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异 PCR 扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高辨别力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
P AFLP 特点: :
AFLP 优点 ：
①所需 DNA 量少，检测效率高，对 DNA 扩增效率高，多态性强，易于辨别。
②AFLP"标记结果稳定牢靠，重复性强,信息量大；多态性丰富，不受基因组来源和简单度的影响，使不同时间、不同试验室的结果可以进行比较，有利于进行回顾性讨论，并促进信息与资料的沟通，达到资源共享。
③AFLP 标记呈典型的孟德尔遗传，可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁，用于构建基因组高密度连锁图谱。
④图谱构建聚类显著，定位专一。
⑤AFLP 对模板浓度不敏感，允许肯定强度的共扩增，样本 DNA 量相差 1000 倍仍可获得相同的结果
AFLP 缺点：
试验成本高。技术繁琐，不易自动化；过程时间长；检测的不是等位片段；费用昂贵； AFLP 标记是显性标记，不能供应完整信息。对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高 7、表达序列标签标记技术（expressed sequences tags)—EST
EST 是从一个随机选择的 cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的 cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp 。EST 来源于肯定环境下一个组织总 mRNA 所构建的 cDNA 文库,因此 EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
首先从样品组织中提取mRNA ,在逆转录酶的作用下用oligo ( dT) 作为引物进行RT -PCR 合成cDNA ,再选择合适的载体构建cDNA 文库,对各菌株加以整理,将每一个菌株的插入片段依据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序,这就是 EST 序列的产生过程。
T EST 特点: :
EST 优点：
①用 EST 标记代替基因组测序使讨论费用大大降低，测序效率大大提高，具有多、快、好、省特点。用 EST 标记也可以直接获得基因表达的信息。
②大量的 EST 测标记累计起来可以建立一个新的数据库，为表达基因的鉴别供应大量信息。
由于 EST 标记来源于 cDNA 克隆，故它们反映了基因组的结构和不同组织中的表达模式。
③EST 来源于编码 DNA，一般其序列保守性强，所以在家系和种界间的通用性比来源于非编码序列的标记好。因此，EST 标记特殊适合于远源物种间比较基因组讨论与数量性状位点信息的比较。EST 图谱将会加速种间连锁信息的传递速度。
④假如发觉一个 EST 标记与一个有益农艺性状连锁，它很可能直接影响该性状。
EST 缺点：
①由于是单次序结果，序列的精确度较低，存在较多错误。(大约2% error，HGP 错误率标准是<0.01 ②重复结果多，不同 EST‘s t 往往来自同一个基因； ③大部分 EST 序列来 IMAGE consortium consortium 的序列在 Washington university 的基因组测序中心测序，占 GENEBANK 中 EST 库的大半，较为牢靠。大部分 dbEST 都有 IMAGE ID，描述其组织或细胞来源，测序状况。由于这些特性，导致目前 EST 面临的最大问题是序列质量不高，存在：①、缺失、替代、插入等变异（与 mRNA 相比）2、测序中的错误引发大约1.5%的采用 oligoT 产生的 EST 无法与已知的 mRNA 的3端比对上3、倒置（5端和3端弄反，插入克隆载体时出错）；4、嵌合 EST（5端和3端来自不同 mRNA）因此，在对 EST 做 Blast 时最好用BlastX 和 Tblastx。
④获得 EST 需要大批量测序，使该技术不适合于中小型试验。
8、简洁序列重复间区标记技术（Inter simple sequence repeat)—ISSR
用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的两个SSR区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以辨别，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特殊丰富，因而可以检测到高的多态性。
ISSR 分子标记的特点 ISSR 优点：
①试验操作简便、快速、高速，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。
②ISSR 标记结合了 RAPD 和 SSR 的优点,所需 DNA 模板的量少、多态性丰富, 重复性好。③无需试剂盒、结果纪录便利、试验成本低、操作简洁、稳定性较高、呈孟德尔式遗传。
④无须知道任何靶标序列的 SSR 背景信息。ISSR 标记技术在引物设计上比 SSR 标记技术简洁多，不需要知道 DNA 序列即可以用引物进行扩增。
ISSR 缺点：
是PCR 扩增时最适反应条件需要肯定时间摸索, 其标记大多为显性标记, 在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳
9 、 多 重 连 接 探 针 扩 增 技 术 （ multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA）— MLPA
是一种针对待检 DNA 序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的转变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的讨论。
A MLPA 特点：
MLPA 优点：
①高效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的转变。
②特异：可以检测点突变。
③快速：一次试验可以在24小时内完成。
④简便：不同的试剂盒操作基本相同，简洁把握。
MLPA 缺点：
①需要精确测量 DNA 的浓度，样本简洁被污染。
②不能用于单个细胞的检测。
③MLPA 用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。
④不能检测染色体的平衡易位。
10、数目可变串联重复多态性 (Variable Number of Tandem Repeats）—VNTR
又称小卫星(Minisatellite DNA) ，是一种重复 DNA 小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。VNTR 基本原理与 RFLP 大致相同。
VNTR 技术特点：
VNTR 优点：
①种类多，多态信息含量较高
②分布广
VNTR 缺点：
①数量有限，而且在基因组上分布不匀称 ②试验操作繁琐、合成探针困难、检测时间长 ③成本高
11.DNA 单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism)—SSCP
SSCP 是指等长的单链 DNA 因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链 DNA 构象分析对 DNA 序列的转变特别敏感，经常一个碱基差别都能显示出来。在 SSCP 分析中，采用 ...