摘 要：介绍了微生物诱变育种的各种方法，对经典的诱变技术、复合诱变和新型的诱变技术等处理方法进行了比较。对离子注入法和等离子体诱变育种等新型诱变育种技术的机理进行了阐述，并对其优缺点以及潜在的研究方向进行了论述。
关键词：微生物诱变；离子注入法；等离子体诱变
中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.34.091
微生物诱变育种是一种基因突变技术，通过技术手段改变微生物的遗传结构和功能，进而筛选出具有特定性状的，优良突变型微生物。这种育种方式，具有较高的微生物变异率，变异速度快，效率高等优点，是食品加工和医药生产等工业的首选方法。
常用的微生物诱变育种方法包括物理法、化学法和生物法等，其中物理法诱变包括：紫外诱变、X射线诱变和γ射线诱变等，化学法诱变包括烷基磺酸盐和烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次乙胺和环氧乙烷类和芥子气类），生物法包括基因转导、基因转化和转座子诱变等。复合诱变是指采用两种及以上的诱变方法，对微生物进行诱变，制的目标菌株。通常仅采用一种方法进行诱变，会使微生物产生抗性，从而降低突变率，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势。
近些年涌现出一批创新的诱变技术，如离子注入诱变法、大气压冷等离子诱变，其中离子注入诱变法具有与复合诱变相似的特性，日趋成为研究诱变技术的主流方向。
原生质体是包含细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性细胞器的生物质，对于微生物来说即去除细胞壁的细胞。原生质体也可以作为诱变的对象，其对外界敏感度很高，因此变异率也很高。
1 经典诱变技术
1.1 物理诱变
1.1.1 紫外诱变
DNA由以嘌呤和嘧啶为碱基的核苷酸组成，紫外线诱变可以使嘧啶形成二聚体，DNA在复制和转录时，因存在嘧啶二聚体而不能分离，进而发生变异。该方法简单、操作安全且诱变率高，其缺点：诱变原理简单，引起的突变单一，形成的突变体类型较少，而对于基因损伤及其修复的研究却很有意义。现在，对于细菌、酵母菌或霉菌的紫外诱变往往是对其原生质体的诱变，缺少了细胞壁对细胞的保护，紫外线可以更直接的作用于DNA，提高突变率，从而产生更多的突变体和表现型。
1.1.2 激光诱变
该方法是利用了激光辐射的光、电、热、压力、磁的综合效应对生物遗传物质引起突变，使细胞中DNA分子吸收、积聚能量并进行能量再分配，导致DNA处于易突变状态，继而发生一系列断键、聚合、交联等变化，从而引起DNA的損伤和突变。该方法优点包括变异类型较丰富、遗传较稳定，缺点是成本较高。
1.2 化学诱变
1.2.1 烷化剂
烷化剂类化学诱变剂是化学诱变常用方法之一，且种类很多，如硫芥、氮芥、乙撑亚胺类、环氧衍生物类、硫酸（磺酸）酯类等。哈霞等以甲基磺酸乙酯（EMS）为诱变剂，对大豆疫霉菌进行诱变，建立了包含640个单卵孢子系的突变体库，50%的诱变菌系在形状和菌落形态方面发生了明显变化，在卵孢子产量方面，8.13%的菌系有增加，20.41%的菌系减少，27.82%的菌系极少或者没有卵孢子产生，43.64%的菌系卵孢子产量类似野生型。并估算甲基磺酸乙酯对大豆疫菌霉的诱变频率至多每115kb发生一个核苷酸变异。
1.2.2 碱基类似物
碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。
1.2.3 移码诱变剂
该类化学诱变剂能引起DNA分子中遗传物质碱基发生移位的一类化学剂。顾真荣等利用吖啶橙诱变枯草芽孢杆菌G3，得到的突变株抗真菌活性提高，合成伊枯草菌素A的能力也增强。
2 复合诱变
该诱变方法是将上述几种诱变方法进行结合，如激光可与紫外结合做复合诱变，取得了良好的效果，韩文霞等首次利用15W的He-Ne激光辐照天麻素合成菌华根霉LN-A的原生质体20min，再用紫外辐照150s得到的突变株，转化率和天麻素得率都显著提高，与出发菌株相比，天麻素得率提高20%以上。祝子坪等利用He-Ne激光与紫外线复合诱变桑黄菌原生质体，筛选出5株变异株S1-S5，且其菌丝发酵产量比出发菌株均有不同程度的提高，具有稳定遗传性，估算表明此复合诱变优于单纯紫外诱变。化学诱变之间也可以做复合诱变，汤卫华等为选育高产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌突变菌株，选用硫酸二乙酯和氯化锂为诱变剂进行复合诱变，得到一株产细菌纤维素能力最高的突变菌株 GO2，其细菌纤维素产量为 9.91 g/L，比出发菌株提高 36.5%。还有物理与化学诱变相结合的复合诱变，Ellaiah 等人通过将紫外险和亚硝基胍进行复合诱变，得到的头孢菌素高产突变株 C 产量较原始菌提高2. 4 倍。
实际上，单纯的物理诱变或化学诱变都可能由于产生的变异种类过于单一或只能产生单个碱基的突变，而没能得到效果好的菌株或得到的突变株不能稳定遗传，而复合诱变由于诱变种类不同，至少产生两种不同的变异类型，从一定程度上弥补了单一诱变的缺陷，因此应用非常广泛。
3 诱变创新技术
3.1 离子注入诱变法
该诱变法本是材料表面改性的一种传统方法，应用时，离子产生器产生的离子在真空环境中（真空可以减少离子碰撞）经适当的加速和筛选，带有相同能量的离子被导入反应室，离子和目标物便开始反应。根据反应能量，将离子大致分为五个等级：热离子（<1eV）、过热离子（1-100eV）、低能离子（0.1-10keV）、中能离子（10-500keV）和高能离子（>500keV）。
3.1.1 离子注入诱变的基本原理
离子注入的对象如果是晶体，离子对其表面的原子作用的宏观现象以及微观过程的研究都可以很清楚，而生物体是由固液气组成的复杂体系，而且不断变化，无论是宏观现象还是微观过程，都很难作出准确的判定，但还是有规律可循的。生物系统中的功能性分子包括DNA、蛋白质、多肽、脂类和激素等，离子的注入对细胞产生影响首先要对这些生物小分子产生作用，而离子对它们不仅有物理的作用和化学的作用，还有生物的效应，不仅有直接的作用，还有间接的作用即次级效应。次级效应是注入的离子与生物分子反应产生的产物与生物分子的反应。当活的细胞受到上述产生的粒子或辐射作用时，这种复杂的效应往往会导致多数细胞死亡，但在少数未死亡的细胞中如果其DNA的损伤以SOS机制修复，则极有可能会引起基因突变，这些突变如果不能导致细胞死亡，就会被保留下来。生物体就是由于这些物理的、化学的和生物的作用造成DNA的损伤和再修复的过程完成变异的。
3.1.2 离子注入对细胞的影响
离子注入对细胞诱变的机理从一定程度上阐述了其对遗传物质的影响，然而它对细胞的其他部分也有相当大的影响。离子注入首先导致的是物理损伤，对于植物或微生物的细胞来说，首当其冲的就是细胞壁，即细胞壁表面的刻蚀，L.D. Yu等通过离子束对植物和微生物细胞壁的刻蚀，研究基因迁移的机理，进而发现细胞壁上的类似纳米孔洞的结构，这些结构可以作为生物大分子转移的通道。为了研究离子注入对细胞通透能力的影响，T.Vilaithong等将低能Ar+离子注入多种植物细胞组织以及大肠杆菌，并测试对台盼蓝（细胞染料，简称TB）染料和质粒这类外生大分子的转移作用，结果表明20keV的Ar离子注入能使TB留在细胞壁中，而30keV的Ar离子注入能使TB进入细胞，这说明一个合适的剂量能使细胞壁的通透能力大大加强。
离子对细胞壁的刻蚀可以增加其通透性，能量稍大的离子可以穿透细胞壁和细胞膜进入细胞质产生进一步反应。如果注入的离子为N+，则N+与水反应可生成HCN和氨基酸，这些都是有机体成分的重要前体。将CO2+或CH4+离子注入氨水或N+注入水中所形成的氨基化合物中，就会形成大量的有机物，其中包括胞嘧啶、D-核糖、D-2-脱氧核糖和NH4H2PO4，而且通过HPLC和1H-NMR分析法可以得到5"-CMP和5"-dCMP。因此，可得出离子与胞内物质发生的反应会很复杂，形成多种有机物，由于细胞内成分非常复杂，而且多变，对于具体的产物及其产生过程的研究非常有难度，这方面内容还鲜有报道。
离子进入细胞后，对细胞影响最大的是与其遗传物质的反应，这是直接影响到细胞存活与否和后代性状的根本因素。Yong Zhao等用能量为30ekV，密度为2×1010 - 8.2×1013 ions/cm2的低能N+离子轰击在铝片表面涂成的pGEM-3Zf（-）质粒膜，质粒中DNA链（包括单链、双链和多链）经电泳检测均出现DNA碎片。Chanisorn Ngaojampa等用不同能量和不同速率的N+离子轰击裸DNA，并用分子模拟来得出DNA分子中的键长不同也使离子注入对DNA造成的伤害有一定的特异性。这也验证了离子注入可以直接作用于遗传物质，并对其造成伤害。
3.1.3 离子注入细胞诱变的实际应用
离子注入基于以上优势，使其在诱变育种中得到广泛应用。He Song等人采用剂量为7×1015ions/cm2，能量为10keV的N+离子注入Arthrobacter NG-1菌诱变，进而制得cAMP高产菌株，与原始菌株相比，产出的cAMP浓度高出41.7%，高达9.79g/L且性狀较稳定。刘国生等以3×1015 ions/cm2剂量的N+离子照射枯草芽孢杆菌，获得两株肌苷高产株产量分别为14.83g/L和14.38g/L，与原始菌株相比，分别提高16.3%和12.8%。
虽然该方法具有很多优点，但是也存在不足之处：该方法对环境严格要求真空，微生物中由于含有大量的水分，在抽真空时，水分的大量蒸发，不仅破坏离子束真空，也使细胞急剧冷却或过度失水而导致失活；离子的高速运动会导致高温，注入时可能因细胞过热而失活。微生物还未开始诱变，就已经大量死亡，这种诱变方法为了适用于微生物的诱变育种，还需要继续探索改进。
3.2 等离子体诱变育种
等离子体是物质的第四态，由大量相互作用的但仍处于非束缚状态下的带电微粒组成的宏观体系，它具有特殊的光、热、声、电和磁等物理性质和化学性质，已经在臭氧合成、紫外光源设备、高功率CO2激光器的制造、碳材料的表面改性等许多领域有着广泛的应用。在前人的许多研究中等离子体作为一种物理灭菌手段，具有快速、低温、操作简便、无毒性及杀灭效果好等优点。等离子体诱变是在其灭菌原理基础上，近几年才起步发展的一种诱变方法。在诱变育种的应用中，由于生物的热敏性只能采用冷等离子，该方法既避免了化学方法的变异专一性和高污染性，也解决了传统物理诱变的变异率低、遗传不稳定等缺点。与近年兴起的离子注入诱变技术相比，此诱变技术对真空腔的要求不高，不会由于真空产生的低温而损伤细胞，也不会由于离子束产生高温而损伤细胞，因此等离子诱变可以很大的提高细胞的存活率，增大诱变效率。因此是很适合于微生物诱变育种的方法。
等离子体诱变的机理解释并未发现系统的研究报道，但等离子体与离子注入的产生源是非常相似的，它们都会产生离子，不同之处在于离子注入可以产生高速离子来刻蚀细胞壁和膜以便离子等进入细胞，而等离子体产生高速电子也可对细胞起到相似的作用。由于目前关于等离子体诱变的机理未见报道，但其诱变机理与灭菌机理是相通的，可以利用灭菌机理来反映诱变机理。Hongxia Liu等研究了氧等离子体灭菌的影响和机理，分析了电子、离子和氧自由基对大肠杆菌杀菌的影响，首先电子和离子刻蚀细胞膜，然后氧自由基破坏细胞膜上的多元不饱和脂肪酸，这是氧等离子体灭菌的主要原理，其中紫外线对细胞的损伤是微乎其微的。从这里可以知道，等离子体诱变中少了高速离子轰击对DNA的影响，取而代之的是高速电子与细胞作用，以及作用产生的自由基及其他次级反应与DNA的作用成为诱变的主要原理。
等离子体诱变是一种比较新的诱变育种方法，研究尚不成熟，目前应用还不多。董晓宇等人用大气压冷等离子介质阻挡放电法，对产1，3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变，结果表明，诱变菌株比出发菌株1，3-丙二醇的质量转化率提高了23%，对数期比生长速率提高了18%。批式流加发酵过程中，1，3-PD 浓度在发酵 36 h 时达到 70.5 g/L，甘油的质量转化率为 0.57 g/g，分别比野生菌提高47%和58%。等离子体诱变有变异范围广、变异稳定，且对条件要求低，必然会成为一种应用广泛的诱变方法。
4 结论与展望
传统的诱变方法由于其变异率低、变异范围窄且遗传不稳定等缺点，复合诱变成为一种很好的选择，但操作繁杂。因此克服了以上诱变缺点的新型诱变方法成为受人们青睐的方法。但离子注入法又因为要求条件较严格，目前不太适用于微生物的诱变育种；而等离子体诱变则克服了这一缺点，因此更有应用价值，但由于这种方法的应用条件和诱变机理尚未完全研究清楚，应用也未广泛，关于此诱变方法还需进一步研究。
参考文献
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