摘要：为开发美国白蛾（Hyphantria curea Drury）植物源驅避剂，本研究采用水蒸气蒸馏法收集美国白蛾非寄主植物刺槐叶片的挥发性化学物质并进行触角电位活性测定。气相色谱-质谱（GC-MS）分析测定结果显示刺槐挥发物共有16种，正二十七烷含量（19.72%）最高，其次依次是正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）、正二十三烷（10.39%）、α-亚麻酸（7.93%）和棕榈酸（6.70%）。美国白蛾雌蛾和雄蛾对烷烃类化合物正二十七烷、正二十五烷和正二十三烷的反应较弱，对植物醇、亚麻酸和棕榈酸反应相对强烈。雄蛾对浓度为10-1（V/V）的亚麻酸反应最强，EAG反应值为1.69，其次是浓度为10-3（V/V）的植物醇，EAG反应值为1.48；雌蛾对浓度为10-2 mg/mL的棕榈酸反应最强，EAG反应值为1.93，其次是浓度为10-4（V/V）的植物醇和10-4 mg/mL的棕榈酸，EAG反应值分别为1.90和1.63。
关键词：美国白蛾；刺槐；挥发性物质；触角电位
中图分类号：S433.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0103-06
Abstract To explore plant repellent of Hyphantria cunea Drury， the steam distillation method was used to collect the green leaf volatiles in the non-host plant Robinta pseudoacacia， and the electrophysiological responses of Hyphantria cunea to the volatiles were determined through EAG technique. The results showed that a total of 16 compounds were identified from Robinta pseudoacacia leave by GC-MS. The amount of heptacosane was the highest （19.72%） in the volatiles， followed by pentacosane （12.36%）， phytol （10.41%）， tricosane （10.39%）， α-linolenic acid （7.93%） and palmitic acid （6.70%）. The electroantennogram analyses indicated that the adults of H. cunea showed stronger EAG responses to phyto， α-linolenic acid and palmitic acid than heptacosane， pentacosane and tricosane. The males H. cunea showed the strongest EAG response to α-linolenic acid at the concentration of 10-1（V/V） and the value EAG was 1.69， followed by 10-3（V/V） of phytol with the EAG value as 1.48. The female H. cunea showed the strongest EAG response to palmitic acid at the concentration of 10-2 mg/mL with the EAG value as 1.93， followed by 10-4（V/V） of phytol and 10-4 mg/mL of palmitic acid with the EAG values as 1.90 and 1.63， respectively.
Keywords Hyphantria cunea Drury； Robinta pseudoacacia； Volatiles； Electroantennogram
近年来化肥、农药等投入品的大量使用造成了农产品质量安全问题日益普遍和农药化肥污染事件频发，阻碍了环境友好型农业的发展进程。因此，农业部提出“公共植保、绿色植保”的植保理念，以农业生产、农产品质量和农业生态环境安全为目标，采取生态调控等环境友好型技术控制农作物病虫害[1]。随着化学生态学研究的深入，植物挥发物的使用已成为在害虫综合治理中主要的化学信息调控策略[2]。通过探明各挥发物的功能，利用这些挥发物可进行害虫防治，如引诱剂、驱避剂的研发。
非寄主挥发物的化学物质组分对害虫的取食、产卵的趋避作用是“推-拉”式防治策略中的重要基础之一，具有良好的应用前景，是国内植物保护研究的热点之一。李思翰等[3]研究表明非寄主植物棉花苗释放的挥发物对蝗蝻产生趋避作用；邢亚等[4]研究表明1 mol/L非寄主植物挥发物橙花醇和香柏油对杨干象雌虫具有较强的驱避作用，驱避率高达81.5%和78.75%；马艳粉等[5]研究表明非寄主植物滇杨挥发物丁香酚在12 mg/L时对马铃薯块茎蛾产卵趋避率为62.1%。了解害虫取食与产卵对寄主选择的行为，可以为制定害虫“推-拉”式等生态控制策略提供理论基础。
重大外来入侵害虫——美国白蛾属鳞翅目灯蛾科，是一种多食性检验检疫性害虫，可危害636种植物，在我国寄主植物达300多种[6， 7]。国内研究表明美国白蛾主要危害桑树、臭椿、白蜡，喜食的寄主植物有榆树、山楂、苹果、梨等，厌食的树种有刺槐、香椿、银杏、国槐、杜仲、苦楝、龙柏等[8， 9]。美国白蛾是否能够识别寄主植物和非寄主植物化学信号，从而造成选择性差异？因此，探索美国白蛾与寄主植物、非寄主植物之间化学通讯很有必要。Tang 等[10， 11]鉴定出喜食寄主植物桑树叶片挥发物成分中有11种对美国白蛾成虫具有触角电位活性，分别是己烯醛、正-3-己烯醛、柠檬烯、反-2-己烯醛、环己酮、正-2-戊烯-1-醇、甲基戊烯酮、二丙酮醇、反-3-己烯-1-醇、β-罗勒烯、2， 4-二甲基-3-戊烯醇，其中β-罗勒烯能够增加雄蛾对性信息素诱饵的吸引力。然而，有关美国白蛾与非寄主植物挥发物反应的研究尚未见报道。
寄主化学信息物质在植食性昆虫的寄主定位過程中的作用非常重要，而触角作为接收植物化学信号的嗅觉器官，对昆虫定位寄主植物、寻找配偶和产卵场所起着重要的作用[12]。昆虫触角电位仪（EAG）用于鉴定昆虫对植物挥发性物质的电生理反应，通过 EAG 反应值的大小来判断挥发性物质对昆虫是否有活性。
为探明美国白蛾非寄主植物挥发物与其化学通讯之间的交互作用，通过GC-MS方法鉴定出美国白蛾非寄主植物刺槐挥发物成分，并且通过电生理试验验证这些化合物对美国白蛾成虫是否具有触角电位活性，为研制和开发驱避剂、开展美国白蛾的综合防控及生态调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 刺槐叶片挥发性物质分析
1.1.1 提取方法 刺槐叶片于2016年6月采自天津市西青区大柳滩村。采用水蒸气蒸馏法进行提取：将新鲜的刺槐叶片用水冲洗干净，剪碎，准确称取1 000 g放入水蒸气精油提取设备中，在蒸馏瓶中加入蒸馏水，水面没过叶片为宜，持续蒸馏4 h。用正己烷对蒸馏物进行萃取，采用分液漏斗分液，保留含有挥发物质的上层液体并用无水硫酸钠去除多余的水分，再用旋转蒸发仪去除正己烷，最终获得淡黄色精油。用正己烷稀释精油，进行GC-MS分析。
1.1.2 样品分析条件 气相色谱采用Agilent 6890N（Santa Clara，CA，USA），质谱为5973MD。使用HP-5MS柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）进行分析。加热程序起始温度为60℃，保持1 min，然后以10℃/min的速率上升到180℃，保持1 min，再以20℃/min的速率上升到280℃，保持15 min。进样口的温度设为270℃。1 μL精油用100 μL丙酮稀释进样，1∶10分流比，柱中流速为1.0 mL/min。扫描质量范围50～550 m/z，速度为2 scans/s。
1.2 美国白蛾对刺槐叶片挥发性物质的触角电位反应
1.2.1 试验昆虫 于2016年7月在天津市农业科学院武清创新基地杨树上采集美国白蛾幼虫，室内饲养至蛹，光照周期为16 h 光照/8 h黑暗，温度为（25±1）°C。羽化1—3日龄的未交配成虫用于触角电生理反应测试。
1.2.2 触角电位反应测试化合物 选择刺槐叶挥发物中含量较高的6种化合物（正二十七烷、正二十五烷、植物醇、正二十三烷、α-亚麻酸和棕榈酸）用于EAG试验。测试的化合物标准品来源见表1，植物醇和α-亚麻酸用液体石蜡进行稀释，按照体积比设置5个浓度梯度，分别为1、10-1、10-2、10-3、10-4 （V/V），石蜡作为对照。固体试剂正二十七烷、正二十五烷、正二十三烷和棕榈酸用正己烷稀释，配置成1、10-1、10-2、10-3、10-4 mg/mL，正己烷作为对照。
1.2.3 触角电位测试方法 用锋利的刀片将美国白蛾触角从基部切下并将其尖端切除少许后，用导电胶将其横搭在电极上，气味混合管与触角相距1 cm，以液体石蜡（正己烷）为对照。连续气体流量300 mL/min，刺激气体流量20 mL/min。取刺激样品10 μL滴于滤纸条（2 cm × 2 cm）上，管口一端连接刺激气体控制装置，另一端插入气味混合管上的侧孔，待基线稳定后用脚踏板人为给予刺激，每次刺激时间为0.1 s，两次刺激间隔时间为1 min，以使触角状态恢复。
刺激化合物的每一个浓度前后各测一次参照化合物即标准品溶剂的反应值。每根触角重复4次，每个处理重复4根不同的触角。样品的触角电位反应值按照以下公式进行校正，以消除溶剂带来的影响。
式中，RC为测试样品的触角电位反应值；RC-1为测试样品前空白对照的触角电位反应值；RC+1为测试样品后空白对照的触角电位反应值。
数据采用SPSS 17.0进行统计分析，Turkey法进行差异显著分析。
2 结果与分析
2.1 刺槐叶片挥发性物质GC-MS总离子流图
通过水蒸气蒸馏法利用GC-MS对非寄主植物刺槐叶片挥发物成分进行分析，获得其总离子流图（图1），扣除杂质峰，共分离得到16个有效峰，可以认为此16个峰几乎代表了自然状态刺槐叶片的挥发物。
2.2 刺槐叶片挥发性物质GC-MS分析
采用仪器自带谱库，运用计算机检索，结合人工解析各个峰对应的质谱图，从刺槐叶片气味中共鉴定出16种化合物（表2）。相对含量超过10%的有4种，占总含量的52.88%，分别是正二十七烷（19.72%）、正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）和正二十三烷（10.39%）；相对含量超过5%的有2种，占总含量的14.63%，分别是α-亚麻酸（7.93%）和棕榈酸（6.70%）。
2.3 美国白蛾对刺槐叶片挥发物的触角电位反应
美国白蛾雄成虫对正二十七烷没有强烈的反应；雌成虫的反应整体趋势呈倒“V”字型，随着浓度的增加EAG相对反应值增加，当浓度达到10-3 mg/mL时反应值（1.11）达到最高，之后随着浓度的增加反应值降低（图2）。雄成虫对正二十五烷高浓度具有触角电位活性，在高浓度（1和10-1 mg/mL）反应值分别为1.08和1.05；而雌成虫随着浓度的变化，EAG反应值上下波动，各个浓度之间无显著差异。雄成虫对正二十三烷的反应随着浓度的增加反应值呈现波动变化，当浓度为10-2 mg/mL时反应值最大（1.34），显著高于其余浓度的反应值；雌成虫对正二十三烷没有反应，EAG反应值均低于1。
美国白蛾雄成虫对植物醇5个浓度的EAG反应较强烈，但各个浓度之间无显著差异，在浓度为10-3（V/V）时反应值（1.48）最高；雌成虫对植物醇的EAG反应值随着浓度的增加反应值整体呈下降趋势，在浓度为10-4（V/V）时反应值（1.90）最高，且显著高于其它4个浓度的反应值。
雄成虫对亚麻酸的EAG反应值随着浓度的增加而增加，当浓度为10-1（V/V）时反应值（1.69）最高，且显著高于其它4个浓度的EAG反应值；雌成虫对亚麻酸的反应值低于雄成虫，5个浓度之间没有显著性差异。
雄成虫对棕榈酸的EAG反应值随着浓度的增加先增加随后降低，在浓度为10-2 mg/mL时反应值最大（1.14），但各个浓度之间无显著性差异；雌成虫对不同浓度棕榈酸的EAG反应值差异较大，在浓度为10-2 mg/mL时反应值最大（1.93），其次是浓度为10-4 mg/mL时反应值（1.63），二者显著高于其它3个浓度的EAG反应值。
3 讨论与结论
植物挥发性物质在植物与植食性昆虫之间的化学通讯中起决定性作用，参与调控寄主定向飞行、取食、交配和产卵场所的选择等行为。每种植物都会释放出其特有的挥发性气味物质，这些物质组成的混合物构成了植物特有的挥发性气味物质的化学指纹图谱。本研究通过GC-MS方法，鉴定出美国白蛾非寄主植物刺槐叶片挥发物成分及相对含量，其中正二十七烷含量（19.72%）最高，其次依次是正二十五烷（12.36%）、植物醇（10.41%）、正二十三烷（10.39%）、α-亚麻酸（7.93%）和棕櫚酸（6.70%），该结果与薛皎亮等[13]报道的刺槐枝叶挥发性物质组成差异较大，可能由于挥发物收集方法不同和品种差异造成的。烷烃类化合物在刺槐叶片中大量存在，含量高达49%，本研究结果与前人结果一致，烷烃类化合物在白蜡、山核桃、黄山栾树、野蔷薇、垂丝海棠、甘蓝等植物挥发物中普遍存在[14-16]。
本研究表明正二十七烷、正二十五烷和正二十三烷在刺槐挥发物中含量较高，而美国白蛾雌、雄成虫对烷烃类化合物的EAG反应值较低（0.81～1.15），但正二十三烷在浓度为10-2 mg/mL时雄成虫的反应值为1.34。蒋兴川等[17]报道甘蓝和玉米挥发物中的二十七烷和二十九烷对亚洲玉米螟初孵幼虫具有引诱活性，张文辉等[18]报道正二十七烷可能与水稻对白背飞虱的抗性有关。因此，烷烃类化合物（如正二十三烷）对美国白蛾雄成虫是否具有引诱或趋避功能需要进一步验证。
有报道表明植物醇浓度为10-2（V/V）时对普通大蓟马有显著的引诱活性[19]，美国白蛾成虫对低浓度植物醇反应敏感程度高，雄成虫在10-3（V/V）时EAG反应值最大（1.48），雌成虫在10-4（V/V）时反应值（1.90）显著高于其它处理浓度的反应值。李玲等[20]研究表明棕榈酸对青杨脊虎天牛雌虫反应敏感程度高于雄虫，本研究结果与其一致，这反映了美国白蛾雌虫和雄虫触角感受器类型不同或存在嗅觉生理方面的定性差异[21]。当棕榈酸浓度为10-2 mg/mL和10-4 mg/mL时雌成虫反应值分别为1.93和1.63，显著高于其余浓度反应值。因此，本试验结果表明同一化合物不同浓度对昆虫触角电位活性存在差异，与前人研究结果一致[22]。
将非寄主挥发物作为驱避剂与寄主挥发物或者性信息素结合应用的“推-拉”策略要优于单纯用引诱剂的效果，可提升对美国白蛾的防控效果。本研究表明美国白蛾雌蛾和雄蛾对植物醇、亚麻酸和棕榈酸的触角电位反应强烈，这3种化合物对美国白蛾是否具有驱避作用或引诱作用仍需做进一步的行为测定。筛选出行为活性最强的单剂及最佳混合配比，可以为美国白蛾绿色防控提供理论依据和技术支撑。
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