摘要 [目的]明确甘草叶斑病菌对戊唑醇和异菌脲的敏感现状，评价甘草叶斑病菌对戊唑醇和异菌脲的抗性风险。[方法]2016—2017年从甘草病叶上分离获得22株甘草叶斑病菌，采用菌丝生长速率法分别测定了各菌株对戊唑醇和异菌脲的敏感性。[结果]22株甘草叶斑病菌对戊唑醇的EC50在0.442 6～2.201 2 μg/mL，平均EC50为（1.180 2±0.426 7） μg/mL，其对戊唑醇的敏感性呈单峰分布，可作为将来进行田间甘草叶斑病对戊唑醇抗药性检测的敏感性基线，抗性指数为0.375 0～1.865 1。22株甘草叶斑病菌对异菌脲的EC50在0.096 4～1.639 6 μg/mL，EC50的平均值为（0.352 7±0.329 8） μg/mL，其对异菌脲的敏感性呈单峰分布，可作为将来进行田间甘草叶斑病对异菌脲抗药性检测的敏感性基线，抗性指数为0.273 3～4.648 7，菌株WW17-16的抗性指数为4.648 7，属于低抗菌株。[结论]所有供试甘草叶斑病菌株对戊唑醇是敏感的，而对异菌脲已有产生抗药性的趋势，生产中需引起高度重视。
关键词 甘草叶斑病；戊唑醇；异菌脲；敏感性
中图分类号 S435.672文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0145-04
Abstract [Objective] The aim was to investigate the sensitivity of A.azukiae and assess the resistance risk of A.azukiae to tebuconazole and iprodione.[Method] The sensitivities to tebuconazole and iprodione of the 22 strains of A.azukiae collected from disease foliage from 2016 to 2017 were determined with the method of colonial growthrate.[Result] The EC50 values of these isolates to tebuconazole ranged from 0.442 6 to 2.201 2 μg/mL，with the mean value of （1.180 2±0.426 7） μg/mL，the sensitivity of these isolates appeared as a single peak curve，which could be used as the relative baseline sensitivity of A.azukiae to tebuconazole.The resistance index ranged from 0.375 0 to 1.865 1.The EC50 values of these isolates to iprodione ranged from 0.096 4 to 1.639 6 μg/mL，with the mean value of （0.352 7±0.329 8） μg/mL，the sensitivity of these isolates appeared as a single peak curve，which could be used as the relative baseline sensitivity of A.azukiae to iprodione.The resistance index ranged from 0.273 3 to 4.648 7.The resistance index of strain WW1716 was 4.648 7，which belonged to low resistance isolate.[Conclusion] All the tested A.azukiae isolates are sensitive to tebuconazole，while have been generated trend of resistance to iprodione and more attention needed to be paid in production.
Key words Leaf spot of Glycyrrhiza；Tebuconazole；Iprodione；Sensibility
甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）屬豆科多年生草本植物，是一种广泛用于医药和食品等行业的大宗植物原料[1-3]，广泛分布于我国西北干旱区域的甘肃和宁夏等省、区的部分地区，其中甘肃省主要分布于河西走廊地区[3]。由豆链格孢（Alternaria azukiae）引起的甘草叶斑病是目前甘草种植中的主要病害之一。近年来，甘肃省的甘草种植面积稳步增加，多年连茬种植致使叶斑病的发生日趋严重，影响了光合作用，由于防治措施不合理，导致甘草产量和品质明显降低，发病严重时病叶率高达80%以上，成为影响甘草生产的主要障碍[4-5]。
由于甘草叶斑病在甘肃省严重发生的历史不长[4]，尚未有针对该病害防治的技术储备，也无药剂登记用于该病害的防治。目前，对甘草叶斑病除采取以加强栽培管理为基础的农业防治外，控制该病的主要手段仍然是使用在其他作物上登记的用于防治链格孢引起病害的化学农药。异菌脲是一种广谱触杀型保护性的二甲酰亚胺类杀菌剂，也具有一定的治疗作用，适用于防治农作物的灰霉病和早疫病等多种病害。异菌脲的作用位点单一，推广大量使用后不久，田间就出现了抗药菌株，导致异菌脲防效的下降，甚至失效[6]。戊唑醇是一种三唑类杀菌剂，通过阻碍真菌麦角甾醇的生物合成引起真菌细胞膜的破环和细胞死亡，对多种农作物病害具有良好的防治效果[7]。异菌脲和戊唑醇尽管已经在多种农作物上登记使用，但鲜见在甘草上登记用于防治叶斑病。鉴于此，笔者开展了甘肃省甘草叶斑病种群对常用杀菌剂的敏感性离体评价，以期为进一步研究杀菌剂的田间防效和有效防治技术以及杀菌剂抗性监测和治理提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试药剂
96%异菌脲（Iprodione）和97%戊唑醇（Tebuconazole）均由山东潍坊润丰化工股份有限公司提供。2种杀菌剂原药分别溶于二甲基亚砜（DMSO），配成浓度为50、250、500、2 500、5 000 μg/mL的戊唑醇母液和浓度为0.5、5.0、50.0、500.0、5 000.0 μg/mL的异菌脲母液，4 ℃保存，备用。
1.2 病原菌的分离
2016—2017年在甘肃省武威市和榆中县采集典型叶斑病病样，经常规组织分离法分离甘草叶斑病菌。根据柯赫氏法则把所分离的叶斑病菌回接到甘草叶片，接种15 d后产生相同病害症状且在病斑上发现相同病菌时，把该病菌判断为叶斑病病原菌。
1.3 甘草叶斑病菌对2种杀菌剂的敏感性鉴定
采用生长速率法。将预培养7 d的甘草叶斑病菌用6.5 mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼，把菌饼分别接种到含有0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μg/mL异菌脲和0、0.1、0.5、1.00、5.00、10.00 μg/mL戊唑醇的PDA培养基上，每个处理重复3次。将接种后的平板放入25 ℃培养箱中，黑暗培养7 d，对照（加1 mL DMSO）菌落直径至少40 mm时，采用十字交叉法测定菌落直径。
1.4 数据统计 用Excel 2010软件计算各处理的抑菌率，将抑菌率转化为几率值，药剂浓度转化为对数值，求出毒力线性回归方程，根据方程计算有效抑制中浓度（EC50）。以EC50对数值为横坐标，菌株分布频率为纵坐标，绘制频率分布柱状图。用SPSS 17.0软件对EC50做正态分布检验。根据病原菌对异菌脲和戊唑醇的敏感性频率分布曲线建立病原菌对异菌脲和戊唑醇的敏感性基线，确定抗性指数和抗性菌株频率。抗性指数≤3为敏感菌株；3<抗性指数≤10为低抗菌株；10<抗性指数≤100为中抗菌株；抗性指数>100为高抗菌株[8-9]。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离与鉴定
2016年在武威市共分离出5株叶斑病菌。2017年在甘肃省的2个地区共分离出17株甘草叶斑病菌。其中，在武威市共分离出14株叶斑病菌，在榆中县共分离出3株叶斑病菌（表1）。
2.2 甘草叶斑病菌对2种杀菌剂的敏感性反应
2.2.1 甘草叶斑病菌对异菌脲和戊唑醇的敏感性分析。
采用菌丝生长速率测定法，测定分离来自甘肃省各地区的甘草叶斑病菌对2种杀菌剂的敏感性（表1）。异菌脲的敏感性测定结果显示，所测定的22株菌的EC50分布在0.096 4～1.639 6 μg/mL，EC50的平均值为（0.352 7±0.329 8）μg/mL，最不敏感菌株WW17-16的EC50是最敏感菌株WW16-5的17.01倍，最敏感菌株和最不敏感菌株都来自武威市，说明供试甘草叶斑病菌对异菌脲的敏感性存在一定差异。不同年份和不同地区分离的甘草叶斑病菌对异菌脲的敏感性之间不存在差异（表2）。
戊唑醇的敏感性测定结果显示，测定的22株菌的EC50分布在0.442 6～2.201 2 μg/mL，EC50的平均值为（1.180 2±0.426 7）μg/mL，最不敏感菌株WW17-11的EC50是最敏感菌株YZ17-3的4.97倍，最敏感菌株YZ17-3来自榆中县，最不敏感菌株WW17-11来自武威市，说明供试甘草叶斑病菌对戊唑醇的敏感性存在一定差异。不同年份和不同地区分离的甘草叶斑病菌对戊唑醇的敏感性之间无显著差异（表2）。
2.2.2 甘草叶斑病菌对2种杀菌剂敏感基线的建立。
甘草叶斑病菌对异菌脲的EC50分布在0.096 4～1.639 6 μg/mL，经SPSS软件的正态检测得P=0.795>0.05，表明这22个菌株对异菌脲的敏感性频次分布符合正态分布，呈连续的单峰曲线（图1A），试验所得22株菌的平均EC50（0.352 7 μg/mL）可作为甘草叶斑病菌对异菌脲的敏感基线。
甘草叶斑病菌对戊唑醇的EC50在0.442 6～2.201 2 μg/mL，经SPSS软件的正态检测得P=0.801>0.05，表明这22株菌对戊唑醇的敏感性频次分布符合正态分布，呈连续的单峰曲线（图1B），试验所得22株菌的平均EC50（1.180 2 μg/mL）可作為甘草叶斑病菌对戊唑醇的敏感基线。
2.2.3 甘草叶斑病菌对2种杀菌剂的敏感程度分析。
根据测定的甘草叶斑病菌对异菌脲的敏感性基线值（0.352 7 μg/mL），抗性指数为0.273 3～4.648 7。所有供试菌中，抗性指数低于3的菌有21株，属于敏感菌株，频率为95.45%；抗性指数在3～10的菌有1株，该菌来自武威市分离的WW17-16，抗性指数为4.648 7，属于低抗菌，频率为4.55%。说明武威市的甘草叶斑病菌已有对异菌脲产生抗药性的趋势。
根据测定的甘草叶斑病菌对戊唑醇的敏感性基线值（1.180 2 μg/mL），抗性指数为0.375 0～1.865 1。所有供试菌的抗性指数均小于3，属于敏感菌，表明2016年和2017年甘肃省各地区分离的所有菌对戊唑醇是敏感的（表3）。
3 结论与讨论
甘草作为甘肃省主要的经济作物，种植面积逐年稳步增加，为当地农民的脱贫致富起到了积极作用。然而近年来，甘草叶斑病发生逐年递增，成为影响甘草产量和品质的主要因素。由于对该病害的重视程度不足，研究投入缺乏，导致在病害发生后缺乏有效的防控措施，致使损失惨重，已成为甘肃省甘草生产中病害防控的主要问题之一。目前，甘草叶斑病的防治主要还是依赖使用链格孢引起病害防治的化学药剂。尚未有甘草叶斑病上登记使用的化学药剂，而室内敏感性测定结果可以为田间防治提供一定参考。
该研究通过评价采自甘肃省武威市和榆中县的22株甘草叶斑病菌对异菌脲和戊唑醇的敏感性，以2种药剂EC50的平均值作为其敏感基线，为有选择性地开展田间药效试验以及定期监测甘肃省甘草叶斑病菌种群抗药性提供了依据。该研究表明，异菌脲对甘草叶斑病菌的平均EC50是0.352 7 μg/mL，21株菌的抗性指数低于3，1株菌的抗性指数在3～10，属于低抗菌，说明武威市的甘草叶斑病菌已有对异菌脲产生抗药性的趋势。这结果与异菌脲对草坪草币斑病菌[10]、草莓灰霉病[11-12]均产生抗药性的结果一致。异菌脲与同属于二甲酰亚胺类杀菌剂存在交互抗性[11]，因此，应该限制这类杀菌剂的使用或减少使用次数，建议优先选用其他作用机制或类型的新型杀菌剂与之轮换使用。戊唑醇对甘草叶斑病菌的平均EC50是1.180 2 μg/mL，抗性指数均小于3，说明戊唑醇对甘草叶斑病菌有很好的抑制效果，而且未出现敏感性下降的抗药性群体。这结果与戊唑醇对马铃薯早疫病菌[7]、苹果斑点落叶病菌和苹果轮纹病[13-15]均未产生抗药性的结果一致。真菌对戊唑醇产生抗性受多基因控制，在自然界中难以形成抗性群体，因此认为病原菌对戊唑醇在田间产生抗性的风险很低。但是近几十年来因为戊唑醇的大量推广使用，目前开心果枝枯病菌（Botryosphaeria dothidea）[16]和草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[17]对戊唑醇产生了不同程度的抗药性。因此，定时监测甘草叶斑病菌对戊唑醇的抗药性对于今后田间抗药性监测和治理至关重要。为防止甘草叶斑病菌抗药性的产生，在实际应用中需根据甘草叶斑病的发生规律等情况，轮换使用异菌脲和戊唑醇等杀菌剂，以有效控制甘草叶斑病的发生危害。
该研究用于建立敏感基线的菌株数量是22株，不符合统计学对样本容量的要求（≥30），降低了该敏感基线的可靠性。分析不同年份和不同地区分离的甘草叶斑病菌对异菌脲和戊唑醇的敏感性之间的差异性，菌株数量过少，未达到统计学意义上的显著性，不能准确地分析结果。鉴于甘草叶斑病菌对杀菌剂有产生抗药性的趋势，对杀菌剂的敏感性进行连续的监测非常必要。也鉴于该研究中菌株数量不符合统计学的要求，在今后的研究中要满足统计学上样本容量的要求，保证分析结果的准确性和可靠性。
参考文献
[1] 阎合.甘草链格孢叶斑病研究[D].兰州：甘肃农业大学，2009.
[2] 曹雪梅.甘草根腐病病原学研究及室内药剂筛选[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.
[3] 李学斌，陈林，李国旗，等.中国甘草资源的生态分布及其繁殖技术研究[J].生态环境学报，2013，22（4）：718-722.
[4] 阎合，徐秉良，梁巧兰，等.甘草叶斑病的发生与病原菌鉴定[J].植物保护，2009，35（3）：111-114.
[5] 王婧，翟伟卜，高环，等.链格孢引起的病害严重危害农作物生产并危及农产品安全[J].植物保护，2017，43（4）：9-15.
[6] 何美仙，符雨诗，阮若昕，等.柑橘链格孢褐斑病菌对4种新型杀菌剂敏感性评价[J].浙江大学學报（农业与生命科学版），2016，42（5）：535-542.
[7] 姚亮亮，张铉哲，赵宇.黑龙江省分离的马铃薯早疫病病菌对腐霉利和戊唑醇的敏感性分析[J].作物杂志，2011（3）：29-33.
[8] 兰波，李湘民，黄瑞荣，等.江西省稻瘟病菌对富士一号的抗药性研究[J].江西农业大学学报，2007，29（3）：351-355.
[9] 袁杰，杨学辉，何海永，等.贵州省稻瘟病菌对三环唑敏感性研究[J].西南农业学报，2006，19（2）：219-221.
[10] 胡健，杨静雅，李婕，等.草坪草币斑病菌对甲基硫菌灵、异菌脲和丙环唑的敏感性[J].农药学学报，2017，19（6）：694-700.
[11] 陈帅民，芦帆，张璨，等.北京地区草莓灰霉病菌对异菌脲的抗性及抗性分子机制[J].植物保护，2015，41（5）：100-104.
[12] 潘以楼，朱桂梅，郭建.江苏草莓灰霉病菌对5种杀菌剂的抗药性[J].江苏农业学报，2013，29（2）：299-304.
[13] 任璐，史晓晶，姚众，等.苹果斑点落叶病菌对戊唑醇敏感基线建立及抗性突变体适合度[J].植物病理学报，2017，47（3）：380-388.
[14] 范昆，曲健禄，李林光，等.苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感基线及其室内抗药突变体研究[J].果树学报，2013，30（4）：650-656.
[15] 范昆，付丽，李晓军，等.苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性及其抗性突变体的致病力[J].植物保护，2017，43（1）：140-147.
[16] MA Z H，MORGAN D P，FELTS D，et al.Sensitivity of Botryosphaeria dothidea from California pistachio to tebuconazole[J].Crop protection，2002，21（9）：829-835.
[17] 顾春波，姜莉莉，王开运，等.抗戊唑醇草莓枯萎病菌ZY-W的诱导及其生物学特性[J].中国农业科学，2010，43（14）：2897-2905.