摘要：目的 观察肠艾舒对荷瘤小鼠CT-26大肠癌的抑瘤作用及其对肿瘤组织Ki67、PCNA表达的影响。方法 将40只BALB/c小鼠随机分为4组，右前腋下接种CT-26细胞造模，空白组（NS 0.6 mL）、化疗组（卡培他滨205.5 mg/kg）、中药高剂量组（肠艾舒51.38 g/kg）、中药低剂量组（肠艾舒17.13 g/kg）隔日灌胃，15 d后计算抑瘤率，免疫组化法检测肿瘤组织Ki67、PCNA的表达。结果 与空白组比较，化疗组、中药高剂量组、中药低剂量组抑瘤率分别为43.35%、29.48%、13.30%；与空白组比较，各治疗组Ki67、PCNA标记指数差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 肠艾舒对小鼠CT-26大肠癌的体内生长有一定抑制作用，可能与其下调肿瘤组织Ki67、PCNA表达有关。
关键词：大肠癌；肠艾舒；抑瘤作用；Ki67；PCNA；小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0052-03
大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在发达国家恶性肿瘤中居第2位，其粗发病率约为每年40/10万～66/10万人[1]，我国为大肠癌低发地区，但发病率呈逐渐上升趋势，发病率约为15.7/10万人，在恶性肿瘤中占第4位[2]。手术及化疗是大肠癌的主要治疗手段，手术切除后大肠癌患者5年生存率约为70%，有40%～50%的患者出现术后复发和转移，其中绝大多数失去再治愈的机会[3]。目前，综合治疗肿瘤已成为趋势，中医药扶正祛邪、软坚散结等作用可增强机体抵抗力、抑制肿瘤细胞活性、减少复发转移、延长患者生存期，已成为大肠癌综合治疗不可缺少的手段。为揭示肠艾舒的抗癌作用，我们用小鼠CT-26大肠癌细胞造模，通过体内实验观察肿瘤生长情况，并采用免疫组化方法检测Ki67和PCNA在大肠癌组织中的表达，探讨肠艾舒抗肿瘤的作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物
ALB/c小鼠，8周龄，雌雄各半，体质量17～26 g，购于成都达硕生物科技有限公司，动物合格证号：0002735。
1.2 药物与瘤株
肠艾舒（由太子参、白术、茯苓、薏苡仁、重楼、天龙、野葡萄根等组成）中药饮片购自云南省中医医院；卡培他滨片，上海罗氏制药有限公司（国药准字H20073024）；小鼠大肠癌CT-26细胞株，云南省肿瘤研究所提供。
1.3 主要试剂与仪器
PBS（批号NYH0959）、小牛血清（批号NYH0929）、1640（批号NYH0953）、双抗（批号NYH0969）、胰酶（批号NYH0949）均购自thermo HYclone公司。一次性细胞培养瓶（GIBCO公司），CO2培养箱（Forma公司），高速低温离心机（Heraeus）。
1.4 造模
复苏小鼠大肠癌细胞株CT-26，用含10%标准小牛血清（Hyclone）的1640（Hyclone）全培养基常规传代培养。将对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，吹打成细胞悬液，1000 r/min离心5 min弃上清液，加适量生理盐水调整为适宜浓度l×l07个/mL，接种于BALB/c小鼠右前腋下，每只小鼠接种0.2 mL。
1.5 药物制备
将肠艾舒复方饮片加4倍体积水浸泡30 min，煮沸后20 min，纱布过滤出药液，药渣再加2倍体积水煮沸，方法同前，合并两次药液，旋转蒸发仪浓缩药液，配置成相应浓度，置于4 ℃冷藏备用。
1.6 分组与给药
将40只小鼠正常喂养3 d后造模，并按雌雄随机分为空白组（生理盐水0.6 mL/20 g）、化疗组（卡培他滨205.5 mg/kg）、中药高剂量组（肠艾舒51.38 g/kg）、中药低剂量组（肠艾舒17.13 g/kg），隔日灌胃。
1.7 肿瘤生长情况观察
接种15 d后停药48 h处死动物。剥离肿瘤，称重，计算抑瘤率[（对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%]。
1.8 肿瘤组织Ki67、PCNA表达测定
肿瘤组织固定后做病理检查。采用免疫组化染色法检测CT-26瘤组织中Ki67、PCNA的表达。Ki67、PCNA单克隆抗体和试剂盒由云南省中医医院病理科提供，操作步骤按说明进行。Ki67定位于细胞核中，阳性者细胞核呈棕褐色颗粒，PCNA定位于细胞核，阳性者细胞核内或细胞浆内出现棕黄色颗粒。分别由病理科医师在不知情前提下，在40倍镜下随机观察5个视野，计数阳性细胞数，取平均值，即为抗原阳性细胞标记指数。
1.9 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用方差分析各组间差异，2组比较采用配对t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肠艾舒对小鼠大肠癌抑瘤率表达的影响
各给药组大肠癌抑瘤率分别为43.35%、29.48%、13.30%，与空白组比较，化疗组、中药高剂量组平均瘤质量降低，差异有统计学意义（P<0.01），中药低剂量组平均瘤质量降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 肠艾舒对小鼠大肠癌Ki67、PCNA表达的影响
Ki67阳性表达于细胞核，为棕褐色颗粒（见图1）， PCNA定位于细胞核，阳性者细胞核内或细胞浆内出现棕黄色颗粒（见图2）。与空白组比较，各治疗组Ki67标记指数降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；化疗组与中药高剂量组比较Ki67标记指数差异无统计学意义（P>0.05）；化疗组与中药低剂量比较Ki67标记指数差异有统计学意义（P<0.01）；中药高剂量组与中药低剂量组比较Ki67标记指数差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较，各治疗组PCNA标记指数差异均有统计学意义（P<0.01）；化疗组与中药高、低剂量组比较PCNA标记指数差异有统计学意义（P<0.01）；中药高剂量组与中药低剂量组比较PCNA标记指数差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3 讨论
刘氏等[4]运用抗癌防移片配合化疗治疗中晚期大肠癌，结果显示中药配合化疗与单纯化疗组相比可提高晚期大肠癌的局部控制率，减轻化疗毒副反应，提高患者生活治疗。赵氏等[5]研究结果显示，中药组小鼠抑瘤率为52.3%，瘤质量、肝转移灶等明显小于模型组（P<0.05）。舒氏等[6]认为气阴两虚、余毒未尽是大肠癌术后的主要病机。姜氏等[7]研究认为，结直肠癌的病情演变多有脾肾两虚、气血两虚→脾虚湿毒→湿热瘀毒、肝肾阴虚→病情恶化、死亡的病机传变规律，故治疗上应以扶正培本、清热解毒为主。
本实验结果显示，中药高剂量组抑瘤率为29.48%，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。在实验中我们发现，中药组小鼠体态特征未见明显变化，精神状态良好，而化疗组小鼠体质量明显减轻，精神萎靡。提示化疗组的抑瘤率较高，但有明显的毒副作用，而中药组抑瘤率稍低，但无明显的毒副作用。
本实验同时采用免疫组化方法检测了小鼠肿瘤Ki67、PCNA表达情况。Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，在增殖细胞的细胞核中表达，而在静止期细胞不表达，是评估细胞增殖活性较好的指标[8]。Ki67免疫组化染色可标记所有G0期以外的细胞，因而也被称为细胞的增殖指数。Ki67的阳性率越高，增殖期的细胞比例就越高，肿瘤生长快，恶性程度高。增殖期的肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性较高，所以， Ki67比例高的肿瘤往往对化疗敏感，化疗效果好。有研究表明，Ki67的表达与肿瘤的部位、淋巴结转移、Dukes分期及生存时间有关，并可能成为影响大肠癌患者预后的一个重要因素[9]。本实验结果显示，与空白组比较，各组Ki67标记指数差异均有统计学意义（P<0.05），说明肠艾舒可以使增殖期肿瘤细胞减少，减缓肿瘤生长。不同剂量肠艾舒的作用效果不同，中药高剂量组Ki67标记指数与化疗组比较差异无统计学意义（P>0.05），而中药低剂量组Ki67标记指数与化疗组比较差异有统计学意义（P<0.05），同时中药高剂量组Ki67标记指数与中药低剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。肠艾舒抑制肿瘤细胞增殖的作用可能与方剂中重楼、天龙、野葡萄根等作用相关，且与剂量呈正相关。观察荷瘤小鼠生活状况，中药高剂量组明显优于化疗组。
PCNA是Miyachi等于1978年在系统性红斑狼疮患者血清中首次发现并命名的，是存在于细胞核中的一种蛋白质。PCNA仅在增殖细胞中合成表达，其表达和合成与细胞周期有关。PCNA在G0期及G1期早期不表达，在G1晚期开始表达并逐渐增加，S期达到高峰，到G2期和M期表达明显减少。任何组织细胞都有PCNA表达，在恶性肿瘤细胞中则高度表达。研究表明，大肠腺癌中PCNA表达与肿瘤细胞分化程度、转移情况及预后有显著的相关性[10]。检测PCNA主要是反映细胞处于S期（DNA合成期）的情况，作为评价肿瘤细胞增殖情况的指标[11]。本实验结果显示，与空白组比较，各组PCNA标记指数差异均有统计学意义（P<0.01）；化疗组与中药高、低剂量组比较PCNA标记指数差异有统计学意义（P<0.01），而中药高剂量组与中药低剂量组比较PCNA标记指数差异无统计学意义（P>0.05）。说明中药高、低剂量组和化疗组对肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，PCNA主要在S期表达，卡培他滨主要作用于细胞周期的S期，特异性强，这可能是化疗组与中药高、低剂量组比较PCNA标记指数差异有统计学意义（P<0.01）的原因。而在Ki67的表达中，化疗组与中药高剂量组Ki67标记指数差异无统计学意义，说明肠艾舒抗肿瘤细胞增殖的作用机理可能与细胞周期非特异性药物相似，对所有增殖期细胞均有抑制作用。
肠艾舒对荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖的影响与剂量相关，肠艾舒扶正抗肿瘤的作用与肠艾舒中何种中药相关，肠艾舒是否属于细胞周期非特异性药物等问题有待进一步研究。
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（收稿日期：2013-08-27，编辑：华强）