[摘要] 目的 研究谷胱甘肽转硫酶GSTT1基因缺失多态性及吸烟情况与胃癌易感性的关系。 方法 研究对象为2005年5月～2006年3月在包头地区确诊的胃癌病例（60例）；以同期该地的排除肿瘤病史的一般人群（83例）为对照。采用病例-对照研究的方法，调查研究对象的吸烟情况，以聚合酶链反应（PCR）的技术方法分析GSTT1的基因型。用SPSS 13.0软件分析研究结果。 结果 ①GSTT1（-）基因型的频率在胃癌组和对照组分别为56.7%和39.8%，差异有统计学意义（P < 0.05）；GSTT1（-）者发生胃癌的危险性较GSTT1（+）者显著升高（OR = 1.98，95%CI：1.01～3.89）。②吸烟者的比例在胃癌组和对照组分别为65.0%和34.9%，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05，OR = 3.458，95%CI：1.723～6.939）。③通过两组分层分析，发现GSTT1（-）基因人群中，吸烟者发生胃癌的风险比非吸烟者高（P < 0.05，OR = 11.6，95%CI：3.516～28.266）；吸烟人群中，GSTT1（-）基因者发生胃癌的风险比GSTT1（+）者高（P < 0.05，OR = 4.75，95%CI：1.68～13.41）。 结论 GSTT1基因缺失多态性与胃癌易感性有关；GSTT1基因缺失及吸烟在胃癌的发生中有协同作用。
[关键词] 胃癌易感性；GSTT1；吸烟；病例对照研究
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（b）-0063-04
Relationship of GSTT1 genotypes and smoking on the susceptibility to gastric cancer
SHI Jianquan1 LUO Baojian1 LIU Rongying2 CHEN Yandong2
1.ICU， Beijing Chest Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 101149， China； 2.The Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou 014030， China
[Abstract] Objective To analyze GSTT1 gene polymonphism， smoking and their effects on susceptibility to gastric cancer. Methods The objects consisted of 60 gastric cancer patients from May 2005 to March 2006 in Baotou City， in comparison with 83 population-based controls without tumor. The epidemiological data （smoking） was obtained from all of the above subjects. GSTT1 genotype was determined by a multiplex PCR. The results were analyzed by SPSS 13.0. Results ①The distribution frequency of GSTT1 （-） genotype （56.7%） among the gastric cancer patients was more than the control group （39.8%） （P < 0.05）. In people with GSTT1 （-） genotype， the risk for gastric cancer was higher than the GSTT1 （+） genotype （OR = 1.98， 95%CI： 1.01-3.89）. ②The frequency of smokers （65.0%） among the gastric cancer patients was more than the control group （34.9%） （P < 0.05， OR = 3.458， 95%CI： 1.723-6.939）. ③In people with GSTT1 （-） genotype， smoking markedly increased the risk for gastric cancer （P < 0.05， OR = 11.6， 95%CI： 3.516-28.266）； among the smokers， GSTT1 （-） genotype significantly increased the risk for gastric cancer （P < 0.05， OR = 4.75， 95%CI： 1.68-13.41）. Conclusion The GSTT1 gene deletion is significantly related to the susceptibility to gastric cancer； the GSTT1 gene deletion and smoking have interaction on gastric cancer.
[Key words] Susceptibility to gastric cancer； GSTT1； Smoking； Case-control study
胃癌（gastric cancer，GC）的发生是一个多因素、多阶段的过程，它与环境致癌物、个体的遗传易感性等因素密切相关，因此，与环境致癌物代谢有关的代谢酶（包括GST家族、CYP家族等）基因多态性的问题成了当前肿瘤研究的一个重要方向。GSTT1作为谷胱甘肽S-转移酶（glutathione-s-transferase，GSTs，EC2.5.1.18）家族的重要成员，其基因多态性（包括存在型和缺失型）与肿瘤的关系，也就引起了国内外学者的关注。近年来，国内外的研究报道表明GSTT1基因缺失型与肺癌[1]、肝癌[2]、胰腺癌[3]等多种肿瘤的易感性有关。关于GSTT1基因多态性与胃癌遗传易感性方面的研究，结论尚不统一[4]。本研究中，通过研究吸烟（环境因素）和GSTT1基因多态性（遗传因素）对胃癌发生的影响，为胃癌的病因研究以及一级预防提供依据。
1 材料与方法
1.1 标本来源
所有胃癌病例均来源于内蒙古消化病研究所（设于包头医学院第二附属医院）和包头市肿瘤医院。所有胃癌病例均由组织病理学检查确诊为胃癌。对照组的个体均来自于当地排除肿瘤病史的一般人群。所有标本收集的起止时间为2005年5月～2006年3月。胃癌组患者60例，男43例，女17例，年龄（55.60±8.14）岁；对照组83例，男53例，女30例，年龄（56.33±7.90）岁。胃癌组和对照组的年龄和性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 流行病学调查
由经过培训的医护人员，对所有研究对象（胃癌组和对照组）进行包括性别、年龄、吸烟情况的流行病学调查。对吸烟情况分为“不吸烟”和“吸烟”两种。其中，“吸烟”规定为每天至少吸1支烟，持续1年以上者，达不到这一标准者规定为“不吸烟”。
1.3 主要试剂
①Taq DNA聚和酶，dNTPs，DNA Marker，无菌去离子水均购于加拿大上海Songon生物工程技术服务有限公司。②琼脂糖、EB、Tris、EDTA、硼酸、溴酚兰均购于北京鼎国生物技术有限公司。③DNA提取液：由内蒙古基因诊断研究所提供。
1.4 GSTT1基因型的检测
1.4.1 DNA的提取 取胃癌组患者及对照组的人外周血2 mL，置入加有EDTA的抗凝试管中，于半小时内置于-20℃低温冰箱中冷冻保存或立即进行基因组DNA的提取（提取方法由内蒙古基因诊断中心提供）。
1.4.2 PCR扩增 应用聚合酶链反应PCR方法扩增基因组DNA，参照文献[5]，构建GSTT1和β-珠蛋白基因的引物（表1），其中，β-珠蛋白（268 bp）作为内对照。所有的引物序列均经美国生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的序列比对工具（basic local alignment search tool，BLAST）的验证，并由加拿大上海Songon生物技术有限公司合成（PAGE纯化）。GSTT1基因引物序列为正义链5"-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3"，反义链 5"-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3"。β-珠蛋白基因引物序列为正义链5"-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3"，反义链5"-CAACTTCATCCACGTTCACC-3"。PCR 反应体系15 μL，其中包括模板DNA 3 μL，GSTT1和β-珠蛋白的上下游引物（浓度为25 μmol/L）各0.3 μL、dNTP（浓度为25 mM）0.3 μL、10×buffer 1.5 μL、Tag酶（浓度5 U/μL）为0.35 μL、MgCl2（浓度为25 mM）1.3 μL、无菌去离子水7.35 μL。上PCR仪，PCR反应循环参数：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，60e退火45 s，73℃延伸45 s，共36个循环，最后再73℃延伸10 min后终止扩增。
1.4.3 电泳 取PCR产物15 μL，加2 μL TEB缓冲液，3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。
1.5 统计学方法
所有的统计分析以及统计图的绘制均采用SPSS 13.0软件包。①计量资料的组间比较采用t检验，计数资料的组间比较采用χ2检验，双侧检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。②吸烟、GSTT1基因型的联合作用与胃癌的关系采用分层分析，以比值比OR及其95%的可信区间（confidence interval，CI）表示相对危险度。
2 结果
2.1 GSTT1基因型的检测结果
GSTT1扩增产物的大小为480 bp，内对照β-珠蛋白产物的大小为268 bp，同时出现480 bp及268 bp两条带者即为GSTT1基因存在型，用GSTT1（+）表示；只出现268 bp一条带（β-珠蛋白基因）者为GSTT1基因缺失型，用GSTT1（-）表示，见图1。其中，1、3、4泳道为GSTT1基因存在型，2、5、6泳道为GSTT1基因缺失型，M为marker。
1、3、4泳道为GSTT1基因存在型，2、5、6泳道为GSTT1基因缺失型，M为Marker
图1 GSTT1和β珠蛋白基因PCR产物电泳结果
2.2 胃癌组及对照组GSTT1基因型分布的比较
分别对胃癌组60例和对照组83例进行了GSTT1基因检测，结果表明，胃癌组GSTT1（-）例数为34例，GSTT1（+）例数为26例；同时，对照组中，GSTT1（-）例数为33例，GSTT1（+）例数为50例。GSTT1基因缺失率为56.7%（34/60），明显高于对照组的39.8%（33/83），差异有统计学意义（χ2=3.998，P < 0.05）。携带GSTT1（-）基因型者发生胃癌的危险性是携带GSTT1（+）基因型者的1.98倍（OR = 1.98，95%CI：1.01～3.89）。
2.3 胃癌组及对照组吸烟情况的比较
分别调查胃癌组和对照组的吸烟情况，结果发现，胃癌组中吸烟者的例数为39例，不吸烟的例数为21例；对照组中，吸烟者的例数为29例，不吸烟的例数为54例。胃癌组中吸烟者的比例为65.0%（39/60），高于对照组34.9%（29/83），组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。吸烟者发生胃癌的危险性是非吸烟者的3.458倍（OR = 3.458，95%CI：1.723～6.939）。
2.4 GSTT1基因型及吸烟与胃癌的关系
2.4.1 根据是否吸烟分层分析GSTT1基因型与胃癌的关系 不吸烟人群中，胃癌组和对照组的GSTT1基因型分布差异无统计学意义（P > 0.05），GSTT1（-）基因型未显著增加不吸烟者患胃癌的风险。吸烟人群中，胃癌组和对照组的GSTT1基因型分布差异有统计学意义（P < 0.05）；并且，吸烟人群中，GSTT1缺失型的人患胃癌的风险性是GSTT1存在型的4.75倍（P = 0.003，OR = 4.75，95%CI：1.68～13.41），即GSTT1（-）基因型显著增加吸烟者患胃癌的风险。见表1。
表1 根据吸烟情况分层分析GSTT1基因型与胃癌的关系（例）
2.4.2 根据GSTT1基因型分层分析吸烟与胃癌的关系 GSTT1（+）人群中，吸烟者在胃癌组和对照组中的分布无显著性差异（P > 0.05），吸烟未明显增加GSTT1（+）人群患胃癌的风险。GSTT1（-）人群中，吸烟者在胃癌组和对照组中的分布差异有统计学意义（P < 0.05）；并且，GSTT1（-）人群中，吸烟者患胃癌的风险性是不吸烟者的11.6倍（OR = 11.6，95%CI：3.516～28.266），即吸烟显著增加GSTT1（-）人群患胃癌的风险。见表2。
表2 根据GSTT1基因型分层分析，吸烟与胃癌的关系（例）
3 讨论
胃癌目前依然是导致恶性肿瘤相关死亡的第2位疾病[6]，具有发病率高、转移率高、病死率高、早期诊断率低、5年生存率低等特点[7]，给家庭和社会带来极大危害，因此，进行胃癌的病因学研究，筛选胃癌的易感基因和高危人群，对胃癌进行有效的一级预防（病因预防），就具有十分重要的意义。
谷胱甘肽转硫酶是人体内一组具有重要解毒作用的多基因酶家族，属Ⅱ相代谢酶；它参与致癌物的代谢，是体内重要的解毒机制[8]。目前，将人的胞浆型GSTs同工酶分为四种，即α、μ、π和θ，分别由不同的基因编码。编码GST-θ同功酶的GSTT1基因定位于人类22号染色体q11.23。GSTT1基因在人群中具有基因缺失多态性，可分为存在型GSTT1（+）和缺失型GSTT1（-），亦即一些人不具有GSTT1基因。大量研究表明，不同种族、不同地域的群体，GSTT1基因缺失型的频率差异很大，GSTTl基因缺失型在非洲、亚洲、欧洲人群中分布频率分别为15%～26%、16%～64%和10%～21%[9]。本研究中，通过分析对照组，提示内蒙古地区一般人群GSTT1基因缺失频率为39.8%。
不具有GSTT1基因的个体，由于体内GSTT1基因的缺失，导致机体不能产生有活性的GST-θ同功酶，进而不能有效去除体内亲电子致癌物，这可能增加了体细胞突变的风险并最终导致肿瘤的形成[10]，所以，GSTT1基因多态性可能与癌症易感性有关。本实验中，胃癌组GSTT1基因缺失率为56.7%，显著高于对照组的39.8%，差异有统计学意义（P < 0.05）。携带GSTT1（-）基因型者发生胃癌的危险性比GSTT1（+）者明显升高（OR = 1.98，95%CI：1.01～3.89），提示GSTT1基因缺失型是胃癌的易感基因型。这与Palli等[11]、Zhao等[12]学者的结论一致；但同时Nguyen等[13]、García-González等[14]报道胃癌组和对照组GSTT1基因型频度分布的差异无显著性。国外另一项Meta分析的结果显示[15]，GSTT1基因多态性对不同种族人群胃癌易感性的作用不同：在白种人中GSTT1缺失增加患胃癌风险，在黄种人中GSTT1缺失未增加患胃癌风险。不同作者报道不同种族、不同地区GSTT1基因多态性与胃癌易感性关系的研究结果的不一致，其原因是多方面的：不同地区、不同种族人群中环境因素、生活习惯、遗传特征的差异；胃癌是多种基因、多种环境因素长期相互作用的结果，某种致癌的环境因素可能会掩盖个体GSTT1基因缺失在胃癌发病过程中所起的作用；不同研究中样本选择、样本量大小、研究方法的差异。
烟草燃烧所产生的烟雾中，至少有43种为已知的致癌物[16]，吸烟是一种公认的致癌因素。本研究中，胃癌组的吸烟率明显高于对照组（P < 0.05），吸烟者相对非吸烟者，患胃癌的风险显著上升（OR = 4.75），吸烟是胃癌的危险因素之一，这与Nomura等[17]的观点一致。同时，GSTT1编码的GST-θ同工酶在烟草中的致癌物：乙烯氧化物、环氧丁烷、烃类氧化物的解毒第二时相发挥作用，所以，GSTT1编码的酶的缺失将可能导致烟草中的有害致癌物的解毒障碍，增加相应人群致癌的危险性。近年来，代谢酶系基因多态性、吸烟与肿瘤易感性相互关系的研究备受关注。本研究中，通过两组分层分析（见表1、2）可看出：①GSTT1（-）基因型未明显增加不吸烟人群患胃癌的风险（P > 0.05）；但GSTT1（-）基因型会显著增加吸烟人群患胃癌的风险（OR = 4.75，95%CI：1.68～13.41）。②吸烟未明显增加GSTT1（+）人群患胃癌的风险性（P > 0.05）；但吸烟会显著增加GSTT1（-）人群发生胃癌的风险（OR = 11.6，95%CI：3.516～28.266）。GSTT1（-）基因型且吸烟的人，患胃癌的风险明显提高。GSTT1缺失基因型和吸烟协同作用，共同增加发生胃癌的风险。
总之，本研究认为，胃癌的发生涉及到多种环境因素及遗传因素长期的相互作用。在内蒙古地区，GSTT1缺失基因型是胃癌的易感基因型，吸烟是胃癌的危险因素之一，吸烟和GSTT1（-）基因在胃癌的发生中有协同作用。对于GSTT1基因缺失的这类胃癌的高危人群，应特别加强教育，使其改善生活习惯，尽量杜绝主动吸烟和被动吸烟，定期体检，预防胃癌的发生。
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（收稿日期：2013-10-30 本文编辑：张瑜杰）