摘要：为探明金丝桃素是否具有抗鸡球虫的作用，特进行了金丝桃素体外抗球虫孢子化试验及体内抗球虫试验。体外抗球虫孢子化试验结果表明，金丝桃素浓度达到0.03%即有明显的抑制球虫孢子化的作用；体内抗球虫试验也表明金丝桃素具有抗鸡球虫的活性，服用金丝桃素6、8、10、12 mg/只，其抗球虫指数分别为66.1、100.3、126.0、131.3。研究结果为拓展药物资源应用的新领域、研发抗球虫新药提供了良好基础。
关键词：金丝桃素；鸡球虫病（Coccidiosis in chicken）；孢子化
中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4316—05
鸡球虫病 （Coccidiosis in chicken）是鸡常见且危害十分严重的寄生虫病，是由一种或多种球虫引起的急性流行性寄生虫病[1]。10～30日龄的雏鸡或35～60日龄的青年鸡的发病率和致死率可高达80%[2]。病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢；成年鸡一般不发病，但为带虫者，增重和产蛋能力降低，是传播球虫病的重要病源[3]。国内外使用的抗鸡球虫药物有化学合成和抗生素两大类，现今广泛使用的有20种。我国养鸡生产上使用的抗球虫药品种共有十余种，如地克珠利、氯羟吡啶、磺胺氯丙嗪钠、妥曲珠利、氨丙林、磺胺二甲基嘧啶等。现阶段使用的抗球虫药物大多必须严格控制用量，以免发生药物中毒；如果单独用药则疗效低，往往需要多种药物联合使用才能达到效果，因此使用起来不方便，而且具有严重的抗药性[4]。
金丝桃素具有多种药理作用[5—9]。在动物疾病防治方面，近年来也有很多的研究成果，如金丝桃素对高致病性的H5N1和H9N2亚型禽流感病毒有极强的杀灭作用[10]，对口蹄疫病毒也有良好的抑制作用[11]。
金丝桃素抗鸡球虫方面的研究尚未见报道，由于金丝桃素是一种天然产物，不会出现残留，因此具有明显的优势，该项研究可为鸡场生产高品质的产品提供保障，并为拓展药物资源应用的新领域、研发抗球虫新药提供良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料 40%金丝桃素（成都普瑞法公司）、磺胺氯吡嗪钠（武汉大华伟业医药化工集团有限公司）、胃蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司）。1日龄海兰褐公雏鸡126只由吉林农业科技学院鸡场提供，喂养至13日龄。肉鸡饲料依照标准配制，由吉林农业科技学院鸡场提供。
1.1.2 设备 电子天平 AB204—N （梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司），数显恒温水浴锅 HH—6（常州市华普达教学仪器有限公司），LD4—2A 离心机（江苏江阳科技器械厂），DHP060 恒温培养箱 （上海实验仪器厂有限公司），显微镜K3—210（麦克奥迪实业集团有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 雏鸡的分组 将13日龄雏鸡随机分成7 组，其中4组口服金丝桃素，1组口服磺胺氯吡嗪钠，另设攻虫不给药和不攻虫空白对照各1组。具体分组情况见表1。
1.2.2 球虫的分离及培养 收集患有柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）病鸡（由吉林农业科技学院寄生虫病实验室提供）的粪便，逐日粪检，待到卵囊出现达高峰时，收集粪便，分离卵囊，加入2.5%重铬酸钾，28 ℃培养，让其孢子化，保存备用[12]。
1.2.3 体外抗孢子化试验
1）将按1.2.2方法收集的含卵囊液体（未培养）分成4组，每组含 2.4×106个卵囊，其中1组为空白对照组，其余3组为给药组，金丝桃素按浓度梯度分为1组（0.01%）、2组（0.03%）、3组（0.05%）。用培养皿培养，培养温度为28 ℃，振荡器上培养2 d。
2）记录孢子化后球虫卵囊数。将上述培养后液体用吸管吸取到16×25的细胞计数板上，放入显微镜下，在低倍镜下观察，记录卵囊数（卵囊数/mL=100小格内的细胞数/100×400×10 000×稀释倍数）。将数据进行比较。
1.2.4 体内抗球虫试验
1）将金丝桃素制成碱水溶液，给药组雏鸡分别按每天6、8、10、12 mg/只的剂量连续给药2 d（试验期为8 d），口腔灌服；给药的第1天同时经口灌服接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/只。
2）攻虫不给药组的雏鸡，接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/只，且不进行任何治疗。
3）磺胺药给药组每天在饮水中添加磺胺氯吡嗪钠（0.3 g/L，试验期连续给药8 d），同时在给药的第1天接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/只。
4）临床观察各组雏鸡8 d，随时观察和记录动物的行为，外观活动和粪便、体温等情况。其中血便计分是在接种卵囊后第四至八天，参照Morehouse等[14]的方法按以下标准记分。0分：100%粪便不带血；1分：1%～25%粪便带血；2分：26%～50%粪便带血；3分：51%～75%粪便带血；4分：76%～100%粪便带血。
5）试验结束时，对所有鸡进行称重、统计存活率、相对增重率，剖检记录盲肠病变值，盲肠内容物称重及卵囊数量检测等。
病变计分：参照Johnson等[13]的标准，根据剖检后肠道病变的严重程度记分。病变值=每组平均病变记分×10。
克盲肠内容物卵囊数（OPG）计算：按照McMaster’s法计数。
卵囊值计算：根据盲肠内容物的OPG值（每克盲肠内容物中的卵囊数）按角田清方法换算卵囊值。
抗球虫指数（ACI）计算：采用默克公司的标准计算抗球虫指数。抗球虫指数（ACI）=（相对增重率+存活率）—（病变值+卵囊值）。抗球虫效果判定：ACI值小于120不适于作为抗球虫药，ACI值120～160为有疗效，160～180为疗效中等，180以上为疗效良好。
2 结果
2.1 体外孢子化试验结果
通过体外试验获得孢子化率的数据见表2。由表2可见，第3组对球虫孢子化抑制作用最大，其次是第2组，说明金丝桃素具有抗球虫孢子化作用，而且随着浓度的增加其作用加强。
2.2 体内抗球虫试验结果
2.2.1 症状观察及存活情况 试验期间，给药组的雏鸡精神状况良好，采食正常，只有少部分打蔫，排血便情况也较不给药组要好，产生血便较晚，转好相对较快。不给药组雏鸡精神沉郁，采食量减少，翅膀下垂、蓬松，泄殖腔周围羽毛被粪便污染，闭目呆卧，继而出现拉稀或者血便等现象。试验结束时，金丝桃素给药组雏鸡存活率高，平均存活率73.3%；攻虫不给药组死亡16只，存活率仅为20.0%。金丝桃素各给药组与攻虫不给药组存活率差异极显著（P<0.01），说明金丝桃素确有抗球虫的功效；金丝桃素给药组与磺胺药给药组存活率差异也达极显著（P<0.01），说明金丝桃素的这种给药方式其药效与磺胺类药物相比还有差距（表3）。
2.2.2 血便计分 接种卵囊后第四至八天，参照Morehouse等[14]的方法记分，结果见表4。由表4可见，攻虫不给药组排血便情况明显，病症较重。在第四天出现死亡情况；给药组排血便情况较不给药组要轻，而且好转较快。血便的情况与给药浓度有关，随着给药浓度的提高，血便情况逐渐减轻。
2.2.3 体重变化 由表5可见，试验前各组雏鸡的平均体重为124.30 g/只，差异不显著。试验结束后，金丝桃素各给药组的日增重均高于攻虫不给药组，且金丝桃素各给药组末重均明显高于攻虫不给药组。
2.2.4 盲肠变化及盲肠内容物卵囊计数 对处理8 d的雏鸡进行剖检，按照病变计分标准对盲肠的变化进行记录打分，结果见表6。由表6可见，攻虫不给药组，金丝桃素6、8、10、12 mg/只给药组，磺胺药给药组及空白对照组病变值分别为28、27、25、20、20、10、0。对盲肠内容物的卵囊数进行了统计，结果攻虫不给药组为0.877×106个/g，金丝桃素6、8、10、12 mg/只给药组分别为0.753×106、0.726×106、0.537×106、0.492×106个/g，磺胺药给药组为0.262×106个/g，空白对照组为0。相应的卵囊值除空白对照组为0外，其他各组均为1。病变值和盲肠内容物卵囊数均随金丝桃素给药浓度的增加而下降，说明金丝桃素对鸡球虫有抑制，从而对盲肠有一定的保护作用，降低了其损伤程度。
由表6可见，金丝桃素抗球虫指数在10 mg/只给药组和12 mg/只给药组均达120以上，可判定为有疗效，而磺胺药给药组抗球虫指数达177.3，属于疗效中等，所以金丝桃素给药组的疗效尚不及磺胺药给药组。但金丝桃素各给药组均比攻虫不给药组抗球虫指数明显提高，表明金丝桃素有抗鸡球虫的活性。
3 讨论
3.1 中草药治疗鸡球虫病的效果
我国兽医科技工作者在应用中草药治疗鸡球虫病方面积累了大量的临床经验，已取得了可喜的成绩。越来越多的中草药被证实对球虫病有一定的疗效，如含有常山碱、常山酮的常山对自然感染球虫的病鸡和人工感染柔嫩艾美耳球虫病鸡具有显著的疗效。目前，使用中草药防治鸡球虫病有单方、复方和提取物三种形式。
单味药如常山、苦参、野菊花、丁香叶、蛹虫草、地墨、白头翁、鸭胆子、大蒜、青蒿等具有抗球虫作用，可单独或作复方制剂的主药使用，其所含生物碱是抗球虫的主要成分。赵爱莲等[15]用蛹虫草治疗人工感染的鸡球虫病，抗球虫指数达174，抗虫效果比咪唑苯脲及氯苯胍好。刘其容[16]用常山加水煎汁拌料150 g/L喂患病鸡，严重者用滴管灌服，用药3 d后血便基本停止，球虫病得到控制。
提取有效成分治疗鸡球虫病。陈蒲丹等[17]研究表明，青蒿及其提取物体外能有效抑制球虫卵囊孢子化，青蒿注射液和青蒿颗粒剂的抗球虫指数分别为164.69和155.86，能有效地提高感染鸡的成活率和相对增重率，并能减轻球虫感染引起的盲肠病变，减少血便，具有较好的抗球虫效果。国外也有用中药提取物抗球虫的试验，Youn等[18]用包括苦参、白头翁、柴胡在内的15种中药的提取物进行抗球虫病的试验，结果发现窃衣、苦参提取物治疗组存活率最高，大果榆、朝鲜白头翁提取物治疗组的病变较小，使君子提取物治疗组的增重明显，而槐树、苦参提取物治疗组的血便严重。
金丝桃素是一种二蒽酮类化合物，主要分布在贯叶连翘等金丝桃属植物体内，具有多种生物活性。金丝桃素在体内、体外均有抑制逆转录病毒的作用，具有极强的抗病毒效果，对艾滋病毒早期复制有较强的抑制作用。能引起癌细胞程序性的死亡，具有抗癌作用。能激活单核吞噬细胞等，具有增强免疫的作用。由于金丝桃素具有抗病毒、抗肿瘤、抗抑郁等作用，特别是显著的抗HIV病毒活性，因此引起人们密切关注[7]。
用金丝桃素防治鸡球虫病的研究未见报道，从本研究结果看，金丝桃素具有较强的抗球虫效果，与其他中草药比较疗效差异不大，但和常用的磺胺类药物比较，疗效还有一定的差异。虽然目前抗球虫指数还不是很高，笔者认为主要可能由于对金丝桃素抗球虫的机理尚未完全了解，对金丝桃素体内代谢、作用过程不清，所以对药物使用的剂量及剂型的合理性还缺乏深入理解，如目前使用的碱水溶液就不一定是一个高效的剂型。相信如果解决了这些问题，将会大大提高其抗球虫的效果。
本试验使用磺胺类药物作为对照，主要考虑它的使用比较普遍，对于结果的判定具有一定的参考价值。
3.2 中草药抗鸡球虫的机理
目前对中药抗鸡球虫的机理研究不多，主要是在抑制球虫孢子化和影响血液指标两方面做了些工作。鸡球虫病的感染都是由易感染鸡经口摄取球虫卵囊而引发的。其卵囊只有在孢子化后被鸡吞食才会致病。因此如果在体外减少鸡球虫卵囊的孢子化，即可降低球虫病的感染率。
李玉兰等[19]对影响柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化的因素进行了研究，发现高温、低温、强光均可以降低孢子化的比率，而溶液的性质也可以影响孢子化过程。
中药“球康” （中药复方制剂）2%和5%浓度分别作用1、5、10 h均可以使球虫卵囊的孢子化率明显降低，其中2%浓度作用10 h组和5%浓度作用5、10 h组的孢子化率与2.5%重铬酸钾对照组差异极显著（P<0.01），中药“球康”5%浓度作用10 h对球虫的孢子化率的抑制作用最强，到第六天时，其孢子化率仅为61.05%。这说明中药“球康”可以抑制球虫卵囊的孢子化过程。在相同浓度下，随药物作用时间的延长，球虫的孢子化率降低；在相同的作用时间下则随着药物浓度的提高而提高[20]。
使用不同浓度川楝子、青蒿、珍珠草和蒸馏水（空白对照），每试验组均3个重复，分别作用未孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊后在不同时间测定其孢子化率。结果显示，除珍珠草组外其余各组在12 h均出现孢子化，珍珠草1.0 g/mL、0.5 g/mL作用36 h以内孢子化率均为0；珍珠草0.25 g/mL作用18 h孢子化率为1.71%，而空白对照组已达85%以上。由此表明珍珠草具有很强的抑制鸡球虫卵囊孢子化的作用[21]。
本试验中使用不同浓度的金丝桃素进行的体外抑制球虫卵囊孢子化试验结果也表明金丝桃素具有显著的抑制鸡球虫卵囊孢子化的作用，推测其抗球虫的主要途径可能是通过抑制卵囊孢子化过程完成的。但具体抑制机理及如何影响卵囊孢子的代谢途径等尚不清楚，还需进一步研究。
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