对照组和有氧运动组，运动组的运动方式采用跑台运动。以左室心肌肥厚指数作为判断心室重构形态学的指标；采用Western Blot法检测大鼠心肌组织RhoA、Rac1和Cdc42蛋白表达的变化；采用Real Time PCR观察8周有氧运动对大鼠心肌组织RhoA、Racl和Cdc42 rnRNA转录的影响。结果：8周有氧运动下调大鼠心肌组织内RhoA、Racl和Cdc42的蛋白表达和mRNA转录，但是并未引起心室重构。结论：运动对心肌内Rho GTPases的调控可能是心脏对运动锻炼产生良好适应的分子机制之一。
关键词：心肌组织；有氧运动；Rho GTPses蛋白
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1007-3612（2012）03-0052-04
研究发现，规律的运动可增强心肌组织内抗氧化酶的活性，从而增加了心肌抵抗氧化应激或缺血再灌注等损伤的能力，对心肌细胞起到保护作用。流行病学的资料表明，长期运动锻炼可改善心血管系统的功能，降低心血管疾病的发病率。但运动诱导心肌细胞保护作用的根本机制还不明。Rho GTPases是Ras超家族的小G蛋白，在细胞骨架构建、细胞增殖和基因转录等过程中发挥重要的作用。Rho激酶通过调节肌球蛋白轻链磷酸化/脱磷酸化而参与心肌细胞的收缩调节，越来越多的研究证明这一家族在心血管疾病的发病和转归过程中发挥着重要的作用，它们广泛参与炎症反应、氧化应激损伤和心肌纤维化等病理过程，被认为是治疗心血管疾病的潜在靶点，但RhoGTPases在运动诱导的心肌保护中的作用还未见报道。本研究观察了8周规律跑台运动对大鼠心肌RhoA，Racl和CAt42蛋白和基因转录的影响，以期为有氧运动对心脏功能的影响提供一定的实验室证据。
1、材料与方法
1.1 材料与试剂 实验动物由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供健康雄性、清洁级3月龄Wistar大鼠30只，体重（228±8.0）g。RhoA、Cdc42多克隆抗体和Racl单克隆抗体购自英国Ab-earn。β-actin多克隆抗体和IgG二抗购自美国Pro-teintech Group公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。Reverse Transcription System反转录试剂盒购自美国Promega公司。Power SYBR Green PCR Mas-terMix试剂购自美国ABI公司。考马斯亮蓝蛋白测试盒购自南京建成生物工程有限公司。PCR所需引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
1.2 仪器与设备 本实验所使用的移液器（Eppen-doff，德国），组织匀浆器（Staufen，德国），721型可见光分光光度计（上海菁华），紫外可见光分光光度计（岛津，日本），低温高速离心机（Beckman，美国），电泳仪（北京六一仪器厂），实时荧光定量仪（ABI，美国），生物电泳图像分析系统（上海复日科技）等均由北京体育大学科学研究中心提供。
1.3 运动模型的建立 30只Wistar大鼠均于北京体育大学动物房饲养。昼夜节律人工控制光照（光照时间为6：00-18：00），环境温度22～24*（2，相对湿度50%～65%。国家标准啮齿动物饲料喂养，动物自由进食及饮水，两天换一次垫料，以保持清洁干燥。大鼠在进入动物房前均未进行过跑台运动，适应性饲养一周后，进行适应性跑台运动，速度为10 m/min，每天30 min，共进行5 d。淘汰体重过大或过小及不适应跑台运动的大鼠，最后挑选出24只大鼠进行正式实验。24只大鼠随机分为两组：安静对照组和有氧运动组，每组12只，两组体重无显著性差异。
运动组大鼠的训练方案参照Radak有氧运动模型，共进行8周跑台运动，前2周运动速度为10 m/min，跑台坡度为5%，每天运动30 min，每周运动5 d；两周后，运动速度为22 m/min，跑台坡度为10%，每天运动60 min，运动6周。
1.4 取材 所有动物在最后一次运动后48 h内取材。采用25%乌拉坦腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔，取出心脏，剔除脂肪和筋膜，用预冷的生理盐水洗净，滤纸吸干后用锡纸包裹投入液氮冷冻，然后置于～80℃冰箱保存待测。
1.5 左室心肌肥厚指数测定 称量两组大鼠全心湿重（HWW）、左室游离壁湿重（LVFWW），计算全心重/体重比，左室重量/体重比值（左室心肌肥厚指数）。
1.6 WesternBlot法检测蛋白表达 取心肌100 mg，加入1 mL胞浆裂解液，于冰水浴中电动匀浆，静置30 min后，于4℃，12 000 g，离心30 min，取上清液分装，存于-80℃冰箱待测。采用Bradford法测定总蛋白含量，计算好上样量后，调整蛋白浓度，于100Y；加热5 min使蛋白充分变性。蛋白经SDS—PAGE电泳转至PVDF膜上，经5%BSA室温封闭60 min后，加入一抗（RhoA、Racl、Cdc42以及β-actin一抗浓度均为1：1000），室温下孵育60 man后，4℃过夜。次日将PVDF膜用PBST洗3×10 min后，加入二抗（四种蛋白二抗浓度均为1：4 000）孵育60 min，用PBST洗3×10 min后，于暗室用ECL发光液显影，曝光。胶片经生物电泳图像分析系统扫描后，分析灰度值。
1.7 Rea-Time PCR法检测mRNA转录取心肌组织50～100 mg，加入1 mL Trizol试剂，按TrizolReagent说明书上的步骤抽提总RNA。用紫外分光光度计检测PdXIA纯度并计算P&iA浓度。抽提出的PdXIA存于～80C冰箱待测。选用随机引物，按照反转录试剂盒说明书的步骤将RNA反转录成cDNA，存于-20℃冰箱待测。参照已经发表的文献，设计RhoA，Racl、Cdc42和GAPDH的引物，具体设计见表1。以cDNA为模板，以GAPDH为内部参照基因，加入引物、Power SYBR Green PCR Master Mix试剂，在ABI 7 500实时定量PCR仪上进行荧光定量扩增反应。反应体系组成按Power SYBR Green PCR MasterMix试剂说明书，PCR扩增条件采用ABI 7500实时定量PCR仪的默认设置。目标基因的表达结果采用比较CT法相对定量。
1.8 数据统计 所有实验数据采用平均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，显著性水平为P<0.05。
2、结果
2.1 8周有氧运动对大鼠左心室厚度的影响 如表2所示，同安静对照组相比，有氧运动组大鼠全心重/体重比值与左心室游离壁湿重/体重比值（左室心肌肥厚指数）升高.但是两组间没有显著性差异。
2.2 8周有氧运动对大鼠心肌RhoA的影响 如图1及图2所示，同安静对照组相比，有氧运动组大鼠心肌组织内RhoA mRNA转录明显下调，两组间具有非常显著性差异（P<0.01）；但有氧运动组大鼠心肌组织内RhoA蛋白无表达（P<0.01）。
2.3 8周有氧运动对大鼠肌Racl的影响 如图3及图4所示，同安静对照组相比，有氧运动组大鼠心肌Racl蛋白表达明显下调，两组之间具有非常显著性差异（P<0.01）；且Racl mRNA转录也明显下调，两组之间具有非常显著性差异（P<0.01）。2.4 8周有氧运动对大鼠心肌Cdc42的影响如图5及图6所示，同安静对照组相比，有氧运动组大鼠心肌Cdc42蛋白表达明显下调，两组之间具有非常显著性差异（P<0.01）；且Cdc42 mRNA转录明显下调，两组之间具有非常显著性差异（P<0.01）。
3、讨论
在冠心病、高血压性心脏病、扩张性心肌病、心肌炎等各种慢性心脏疾患的终末阶段都可以导致心肌重构，进而出现慢性心力衰竭（CHF）的临床综合征。对于心肌重构的控制，可以延缓CHF的进展。来自不同实验室不同心力衰竭的大鼠模型研究都显示：无论是由于压力超负荷引起的心力衰竭，还是急性心肌梗死引起的心力衰竭，在心力衰竭组心肌组织中RhoA、Rho激酶mRNA表达水平明显上调，而使用Rho激酶抑制剂可改善心肌梗死后、自发性高血压、压力超负荷大鼠及血管紧张素Ⅱ所引起的心肌肥厚。Rho激酶抑制剂的应用不但结构上左心室的重量、左室腔的直径较对照组有明显的差别，且心肌组织中的RhoA、Rho激酶mRNA的表达也明显下降。这些结果都提示在左室心肌重构的病理过程中Rho/Rho激酶的激活具有重要作用。
Rho/Rho激酶信号通路的关键信号分子包括Rho蛋白、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶。目前以对RhoA、Racl和Cdc42研究最广泛，它们最具特色的功能是对肌动蛋白动力学的调节，比如RhoA调节肌动蛋白应力纤维（Stress fiber）的装配，而Rac和Cxtc42则调节肌动蛋白聚合成特殊的外周结构：Cdc42促进丝状伪足的形成；Rac调节层状伪足的生成及膜皱缩。它们还通过这种效应来调节许多基础的生物功能如收缩、运动、粘附、细胞形状与极性、基因转录等。
近10年的流行病学资料表明规律的有氧运动有益于心脏功能，对冠心病、心力衰竭和心肌缺血再灌注损伤等心脏疾病具有预防和治疗的作用。但运动作为一种特异性应激刺激，随运动方式、时间和强度的不同，对机体包括心血管系统的影响也更为复杂。
本研究发现，8周中等强度的规律有氧运动对左室心肌肥厚指数无影响，但却下调了心肌组织RhoA的蛋白表达和基因转录，其作用类似于Rho激酶抑制剂。这提示运动作为一种特殊的刺激因素通过抑制RhoA/Rho激酶的活性干预左室心肌重构的病理过程，从而延缓慢性心力衰竭的出现。
同时本研究发现8周中等强度的规律有氧运动还下调了Racl和Cdc42的蛋白表达和基因转录。目前多数研究认为运动诱导心肌保护与运动提高心肌抗氧化酶的活性有关。研究发现，NADPH氧化酶与冠心病、心肌肥大和心肌缺血再灌注损伤等多种心脏疾病密切相关，被认为是心血管疾病治疗的潜在靶点。Racl是NADPH氧化酶的组成部分，在NADPH激活的过程中发挥重要作用。他汀类药物通过蛋白质异戊二烯化共价修饰Racl易位至细胞膜，阻碍NADPH氧化酶的激活，减少ROS的产生。有氧运动可以通过激活NADPH诱导产生ROS，但有氧运动又可以明显降低与氧化应激有关的慢性病的发病率。本课题组之前的研究发现有氧运动可以减轻心肌细胞受自由基攻击的程度，并认为这是运动诱导机体对氧化应激产生系统性适应的结果，包括第一线的抗氧化酶活性的提高和第二线氧化损伤修复系统功能的改善。自从首次报道运动过程中ROS产生增多现象至今30余年来，运动、ROS和氧化应激的关系始终是学术界研究的热点。值得一提的是由NADPH介导产生的ROS在机体内起着“双刃剑”的作用，一方面正常范围的ROS是细胞信号转导的关键分子，另一方面过多的ROS又对细胞具有毒性作用。有研究表明，有氧运动激活NADPH氧化酶的同时对其不同亚基存在调节作用，如降低p22phox亚基的基因多态性，下调p67phox表达。本研究发现，8周有氧运动下调心肌组织内Racl的基因转录和蛋白表达，提示有氧运动对NADPH氧化酶的激活可能存在负反馈调节作用，即在激活NADPH的同时抑制Racl的表达从而使NADPH的浓度不至于过高而对组织产生过氧化损伤。而目前对于Cdc42在心脏生理病理过程中的研究还比较少，离体条件下的研究发现Cdc42参与去甲肾上腺素和白血病抑制因子诱导的病理性心脏肥大过程[加]。文献报道，以70%～80%V02max强度连续运动12周可以引起心肌增厚、心腔增大。本实验所采用的运动模型只有8周的运动时间，最大的运动强度也只有60%V02max，虽然本模型对左室心肌肥厚指数无影响，但8周中等强度的运动却下调了Cdc42的表达和转录。总之，以往对Racl和Cdc42的研究更多得集中在其对细胞骨架的调节上，而关于它们在心肌组织重构中的作用仍需进一步研究。
综上所述，本研究结果提示：8周的规律有氧运动可以下调成年大鼠心肌组织中参与左室心肌重构病理过程的RhoA/Rho激酶通路相关信号分子的蛋白表达和mRNA转录，这可能是运动改善心脏功能的机制之一。