【摘要】 目的 观察半枝莲醇提取物对肝纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞凋亡的影响，从细胞凋亡的角度探讨本药治疗肝纤维化的作用机理。方法 将72只Wistar雄性大鼠随机分为正常组10只、观察组62只，建立大鼠肝纤维化模型，4周后造模成功，分别予生理盐水、半枝莲醇提物溶液大、中、小剂量及秋水仙碱灌胃，每天1次；12周末观察处死大鼠肝组织病变结构，并通过免疫组化TUNEL、а-SMA双标记检测实验大鼠肝星状细胞的凋亡情况。结果 半枝莲醇提物能影响活化肝星状细胞的凋亡，改善肝组织的纤维化程度。结论 半枝莲醇提物有一定的抗大鼠肝纤维化作用，其作用机制是通过诱导星状细胞凋亡来实现的。
【关键词】 半枝莲；大鼠；肝星状细胞；细胞凋亡
肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和分解不平衡的病理结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死，使其细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成过多的胶原纤维而导致降解不足从而形成肝纤维化，它是肝硬化的必经阶段［1］。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）目前被公认为是ECM的主要来源细胞，HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节［2］。所以，研究HSC的激活对探索肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义。因此，本实验在前期研究的基础上，从细胞凋亡的角度探讨半枝莲醇提物治疗肝纤维化的作用机理。具体实验报道如下：1 实验材料与方法
1.1 实验动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠72只（购于广西医科大学动物实验中心，动物许可证号：2008-001x），体重为180-220g，随机取2只作为正常组。剩余大鼠进行肝纤维化造模，在第4周末随机处死2只，实验结束时死亡8只，经检查证实肝纤维化形成后，将其余60只肝纤维化大鼠随机分为正常组、模型组、半枝莲醇提物溶液大、中、小剂量组和秋水仙碱西药对照组共6个组，每组10只。
1.2 造模方法 参照韩德五等的实验文献报道［3］并加以改良，采用CCl4复合因素制备大鼠肝纤维化模型，采用高脂低蛋白食物(饲料用玉米面加入0.5%的胆固醇，在实验的第1-2周加20%的花生油饲养，配置10%酒精为唯一饮用水，第1次给CCl40.5mL/100g体重皮下注射，以后每隔3天皮下注射一次40%CCl4-油剂0.3mL/100g体重，2次/周，共6周。为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，各实验组于用药开始后仍注射40%CCl4-油剂0.3mL/100g体重，1次/周。
1.3 给药方法 正常组给予普通饲料喂养，4周后以等容积的生理盐水灌胃；模型组在造模4周后，治疗组给予等体积的生理盐水、大、中、小剂量半枝莲（将半枝莲粉碎，准确称量后加入10倍量的乙醇，浸泡60min，乙醇提取3次，每次120min，浓缩至无醇味后真空干燥，准确称量干燥物1g/100g、0.5g/100g和0.25g/100g体重和秋水仙碱10μg/100g体重灌胃。以上各组灌胃液体量均为1mL/100g体重，每日1次，共12周。
1.4 肝组织HSC凋亡的检测 用药12周后，各实验组大鼠禁食12/h后称重，采取颈椎脱臼法处死大鼠，剖取大鼠肝脏，用10%的甲醛固定，石蜡包埋、切片，行HE染色，在光镜下观察；取肝组织，采用免疫组化（TUNEL和α-SMA）双标记法检测，即肝组织石蜡切片常规脱蜡至水；0.01mol/L枸橼酸缓冲液微波修复3min，冷却后PBS洗；30%H2O2室温孵育5-10min，蒸馏水冲洗，将PBS浸泡5min；与5μl的Enzyme solution相混合，每片加入该混合物50μl，放置入湿盒内孵育60min，用PBS反复冲洗5min，连续3次；滴加TUNEL反应液50μl/片，37℃1h，取出置入PBS中洗5min，共3次；DAB显色，PBS洗5min，共3次，5%BSA封闭液室温孵育30min；倒去血清；滴加稀释的一抗(兔抗α-SMA，1：25)，37℃孵育1.5h，30min，PBS冲洗；滴加二抗（羊抗α-SMA，1：25。抗体购自北京中杉试剂公司），孵育30min（37℃），PBS反复冲洗；滴加SABC，孵育30min（37℃），再次用PBS冲洗；用DAB方法显色，苏木素轻度复染、封片。每片随机取5个400倍的高倍视野下观察，计数凋亡的细胞数目。阳性结果判定方法：每组随机选出5张做成切片，以HSC表达阳性细胞做为计数对象，其中胞质为黄染、胞核呈棕黑色，固缩和变形者为凋亡的HSC。
1.5 统计学处理 各组数据以 χ±s表示。统计学处理采用SPSS11.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果
2.1 各组大鼠一般表现 随着造模时间的延长，模型组中大鼠逐渐出现皮毛色黄稀松且无光泽，进食和饮水量少，喜静卧，活动性差，体重减轻明显，部分大鼠出现大便稀；在整个实验期间，正常组动物皮毛色白紧密且有光泽，饮食情况好，活动性好，体重增加明显。各治疗组在开始用药后，大鼠摄食和体重增加，毛色逐渐光润，活动趋于正常。
2.2 各组大鼠肝组织病理学变化 取各组实验大鼠肝组织进行HE染色，在光镜下显示：正常组中大鼠肝小叶结构清晰、完整，肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列，板间有不规则肝窦，仅于汇管区和中央静脉周围有少许胶原纤维存在；模型组多数正常小叶结构被破坏或消失，由中央静脉和汇管区伸出粗大的胶原纤维条索分割、包绕着肝小叶，肝细胞索排列较紊乱，肝细胞明显水肿，脂肪变性广泛，有部分肝细胞已坏死。纤维隔内有大量单核、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及成纤维细胞等细胞浸润；与模型组比较，各药物治疗组肝小叶结构破坏明显减轻，肝脏中胶原纤维增生也明显减轻，纤维条索疏松变窄。肝细胞水肿、变性情况明显恢复，炎性细胞浸润减少。其中以半枝莲大、中剂量处理组肝脏结构改善较为明显。
2.3 半枝莲醇提物对大鼠肝脏HSC凋亡的影响 在各用药组治疗后，于光学显微镜视野下计数阳性细胞数比例，每张切片计数10个视野，以阳性细胞百分数代表各种蛋白表达阳性率。统计结果分析如下：与正常组比较，模型组、半枝莲各剂量组及秋水仙碱对照组均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，半枝莲各剂量组及秋水仙碱对照组均有所降低(P<0.05)；与秋水仙碱对照组比较，半枝莲大、中剂量组均有所降低(P<0.05)，见表1。
表1 各组大鼠肝星状细胞凋亡（χ±s）情况比较
组别 n 凋亡HSC(个/s400倍镜野）
正常组 10 0
模型组 10 0.24.±0.02①
半枝莲小剂量组 10 0.32±0.04①②
半枝莲中剂量组 10 0.36±0.05①②③
半枝莲大剂量组 10 0.39±0.01①②③
秋水仙碱对照组 10 0.31±0.07①②
注：与正常组比较①P<0.01；与模型组比较②P<0.05；与秋水仙碱对照组比较③P<0.05。3 讨 论
肝纤维化是各种肝损伤后的一种修复反应，其大致发生途径为病毒感染等损伤因子持续作用于肝，导致肝细胞的变性坏死产物、内毒素、脂质过氧化物、花生四烯酸代谢物等炎性介质增多，激活肝脏枯否氏细胞(Kupffer cells，KFC)释放大量细胞因子和活性氧，继之HSC被激活，合成以胶原为主的细胞外基质过度沉积于肝脏。目前已明确，活化后的HSC是过多细胞外基质的主要来源细胞，将是导致肝纤维化的主要细胞。活化增生后的HSC有两种结果［4］：①回到静止状态；②可能通过凋亡等途径死亡，其中的细胞凋亡的途径不但可以减少增生活化后的HSC数量，还可以不引起溶酶体等细胞器的破坏。凋亡的细胞可在数小时内被周围的细胞所吞噬，很少引起微环境的炎症损伤，是一种较为理想的清除增生肝星状细胞的方法。因此，HSC的激活是肝纤维化的关键，其凋亡也是肝纤维化在损伤去除后恢复的关键点，促进HSC的凋亡已成为抗肝纤维化研究的一个新热点［5］。
半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）为广西壮族地区民间治疗慢性肝病常用草药。半枝莲为唇形科植物半枝莲的全草。半枝莲为全草入药，性辛、苦、微寒，入肝、肺、肾经。具有利尿消肿止痛，活血化瘀，清热解毒及抗肝肿瘤等功效。临床多用于咽炎、咽喉肿痛，肿瘤，阑尾炎，肝炎，腹水，肺脓肿，吐、衄血，血淋，肾炎水肿等［6］；根据《中华肿瘤治疗大成》中记载，半枝莲主治原发性消化、呼吸系统囊肿和肿瘤以及妇科子宫颈癌等肿瘤。在《广西民族药简编》及《新华本草纲要》等对其民族临床用药经验均有介绍。现代药理研究表明，半枝莲的粗提物及其有效部位、有效单体具有抗菌、抗突变、抗炎症、解热、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多方面的药理活性［7］。半枝莲是近年来国内外抗肿瘤中药的研究热点，其主要含黄酮类成份，文献报道有20多个黄酮，主要含野黄芩素、野黄芩苷、黄芩苷、红花素、异红花素、白杨素等。此外尚含生物碱、甾类及多糖类化合物，其中以黄酮类成分含量较高［8］。
现代血清药理学是将单味中药或复方经口给予动物灌服定时间后，通过采集、分析动物血液，分离血清，用含实验动物的药物成分血清进行体外实验的一种技术和方法［9］。我们课题组在前期实验研究结果已得出［10-13］：半枝莲水煎液可有效地减少肝组织Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的沉积和拮抗TGF-β1的合成都起到良好的抗肝纤维化作用；半枝莲醇提取物可抑制大鼠肝纤维化脂质过氧化物的生成TGF-β1和PDG的表达。我们前期实验研究证明，该药的醇提物能显著降低肝纤维化大鼠血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ.C)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平，抑制肝纤维化大鼠HSC的活化和增殖、减轻肝脏炎症及纤维化程度、具有抗肝纤维化作用。本实验成功的建立了大鼠肝纤维化模型，TUNEL、а-SMA双标记检测结果显示：在正常组，未见HSC凋亡；模型组在肝窦和胶原沉积处可见大量活化的HSC；半枝莲大、中剂量组HSC凋亡指数明显增加(P<0.05)，其中半枝莲大、中剂量组在肝窦、胶原沉积处可见大量凋亡HSC，半枝莲各剂量组之间存在一定量效关系，大、小剂量组作用较明显(P<0.05)；与模型组相比，半枝莲各剂量组治疗后，HSC凋亡数量增加，且半枝莲大剂量组作用明显，提示半枝莲治疗能加速活化HSC的凋亡，由于HSC数量的明显减少，其形成ECM的能力亦显著降低，从而抑制了肝纤维化的形成。因此半枝莲的抗肝纤维化作用可能是通过诱导肝星状细胞凋亡实现的。
参考文献
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