摘要 [目的] 构建表达鹅细小病毒（GPV）VP3基因的重组腺病毒，为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础。[方法] 以重组质粒pcDNA-VP3为模板，以GPV-VP3为目的基因，构建GPV-VP3重组腺病毒载体，通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒，通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况。[结果] 扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp，线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因，表达蛋白的分子量约为60 Ku。[结论] 该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础。
关键词 鹅细小病毒;VP3基因;重组腺病毒;真核表达
中图分类号 S852.65+7 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）33-11751-04
Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Expressing VP3 Gene of Goose Parvovirus
CHEN Hai-di， GAO Xu， ZHANG Ying et al
（Department of Veterinary Medicine， Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）
Abstract [Objective] The research aimed to construct recombinant adenovirus expressing VP3 gene of goose parvovirus and lay the foundation for making the immunity test and evaluating the immune effects. [Method] Taking recombinant plasmid pcDNA-VP3 as the template， using GPV-VP3 as target gene， the recombinant adenovirus vector of GPV-VP3 was constructed. The recombinant adenovirus that could stably express VP3 gene of goose parvovirus was obtained by transfection. The expression situations of GPV-VP3 were detected by IFA and Western-blot detection. [Result] The complete sequence of amplified GPV-VP3 gene was 1 605 bp. pCR259-VP3 plasmid could transiently express in QBI-HEK293 cells. And the molecular weight of recombinant protein was about 60 Ku. [Conclusion] The construction of recombinant adenovirus laid a foundation for the research and development of a new vaccine of GPV and its experiment in vivo.
Key words Goose parvovirus; VP3 gene; Recombinant adenovirus; Eukaryotic expression
基金项目 吉林省自然科学基金项目（201215230）。
作者简介 陈海迪（1988- ），女，吉林长春人，硕士研究生，研究方向：动物传染病分子生物学与免疫学。*通讯作者，副教授，博士，从事动物传染病分子生物学与免疫学研究。
收稿日期 2014-10-15
鹅细小病毒病（Goose parvovirusis，GP）是由鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的一种雏鹅和雏番鸭最急性、急性、亚急性及高度接触性传染病[1]。该病主要侵害雏鹅，病程短，雏鹅发病后多在1 d左右死亡，根本来不及治疗，死亡率高，给养鹅业带来了巨大的经济损失[2]。防治鹅细小病毒病，接种有效的疫苗是关键。目前，养鹅业大多采用传统疫苗，但存在散毒和灭活不彻底等潜在危险，而基因工程疫苗弥补了传统疫苗的不足。在众多基因工程疫苗中，由于活载体疫苗能够刺激机体产生持久的体液免疫，可长期抵御外来病原体的侵袭，已成为当今新型疫苗研究的热点。在活载体疫苗中，腺病毒活载体疫苗因其安全性高、毒性小、宿主范围广等特点而受到了广大科研人员的关注，相关腺病毒活载体疫苗已进入临床试验或商品化，并取得了很好的免疫保护效果和经济效益[3]。目前，尚未见到有关GPV重组腺病毒载体疫苗的报道。在GPV 3个结构基因中，VP3基因编码的衣壳蛋白可以诱导机体产生中和抗体，使其成为预防GP基因工程疫苗研究的首选靶基因。因此，笔者以改造的腺病毒为载体，以GPV-VP3为目的基因，构建GPV-VP3重组腺病毒载体，通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒，为下一步机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础。
1 材料与方法
1.1 细胞和菌株
重组质粒pcDNA-VP3由延边大学动物医学系预防兽医实验室构建保存;E.coliJM109和DH5α感受态细胞购自索莱宝生物科技有限公司;QBI-HEK293细胞和腺病毒穿梭载体pCR259由日本带广畜产大学原虫病中心玄学南教授惠赠。
1.2 主要试剂
FITC标记及HRP标记的羊抗兔IgG，购自Sigma公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶、pMD19-T Simple Vector及DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自TaKaRa公司;Trizol试剂、Lipofecta mineTM2000转染试剂盒购自invitrogen公司;其他常规生化试剂均为分析纯。
1.3 引物的设计与合成
根据GenBank中登录的GPV-VP3基因序列（AY524421 ），应用Oligo 6.0软件设计合成了1对特异引物，上游P1：5′-CTCGAGATGGCAGAGGGAGGAG -3′（Xho I），下游P2：5′-CGGTCGACTTACAGATTTTGAGTTAG-3′（Sal I），由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.4 GPV-VP3基因的克隆与鉴定
以重组质粒pcDNA-VP3为模板，以P1与P2为引物，PCR反应体系为50 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，30个循环;最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物克隆至pMD19-T Simple Vector，构建质粒pMD19T-VP3。将PCR和酶切鉴定均为阳性的质粒送往上海英骏生物技术公司测序。
1.5 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的构建与鉴定
利用限制性内切酶Sal I和Xhol I双酶切阳性克隆质粒pMD19T-VP3与腺病毒穿梭载体pCR259，各回收目的片段4 ℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，筛选出阳性克隆产物接种于Amp/LB，220 r/min，37 ℃过夜培养。将PCR和酶切鉴定均为阳性的质粒（pCR259-VP3）送往上海英骏生物技术公司测序。
1.6 重组腺病毒rAd-VP3的制备
经Lipofectamine 2000介导，将测序正确的质粒pCR259-VP3转染到QBI-HEK293细胞，37 ℃、5%CO2培养箱中培养5 h，加入1.5 ml含8%血清的DMEM完全培养液过夜培养，此后在第1天和第5天更换含3%血清的DMEM完全培养液，经过7～10 d培养至出现细胞病变后收获病毒，即为原代重组腺病毒rAd-VP3，记为f0代。
1.7 rAd-VP3的RT-PCR鉴定
将f0代重组腺病毒rAd-VP3连续传代，收集第f0、f2、f6、f10、f12代病毒，应用Trizol试剂提取总RNA，以Oligo（dT）为随机引物合成cDNA，利用P1、P2引物进行RT-PCR鉴定。
1.8 IFA检测表达产物 将收集的f0代重组腺病毒rAd-VP3接种于24孔细胞培养板培养的QBI-HEK293细胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293细胞为对照，继续培养48 h后，用预冷的丙酮固定10 min，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗体为一抗，以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，在荧光显微镜下观察结果。
1.9 Western blot检测表达产物
将收集的f0代重组腺病毒rAd-VP3接种于6孔细胞培养板培养的QBI-HEK293细胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293细胞为对照，继续培养48 h，经-20 ℃反复冻融3次后，进行Western blot检测，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，DAB显色后观察结果。
1.10 重组腺病毒rAd-VP3 TCID50的测定
将QBI-HEK293细胞接种于96孔细胞培养板，当细胞生长丰度达70%～80%时，将10倍倍比稀释的F6代重组腺病毒rAd-VP3（共8个稀释度：10-10～10-3）接种到96板中，每个稀释度接种6个孔（100 μl/孔），并设置正常细胞对照组，细胞培养板置于37 ℃、CO2培养箱继续培养，每天观察并记录病变情况，观察6 d，通过Reed-Muench法计算重组病毒的TCID50。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增及克隆
从图1可以看出，经PCR扩增的GPV-VP3基因长度为1 605 bp，与预期大小相符，且测序结果正确。构建的质粒pMD19T-VP3经Sal I和Xhol I双酶切后，出现大小约为2 700 bp和1 605 bp的2个片段（图2），结合测序结果，证明已成功构建pMD19-VP3质粒。
注：M：DL2 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR产物。
图1 GPV-VP3基因的PCR扩增
注：M.DL2000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR鉴定结果;2.质粒pMD19T-VP3的Xho l、Sal I双酶切鉴定结果。
图2 重组质粒pMD19-VP3的鉴定
2.2 重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3的鉴定
限制性内切酶Sal I和Xhol I双酶切阳性克隆质粒pMD19-VP3与腺病毒穿梭载体pCR259，将纯化后的目的片段插入到腺病毒穿梭载体pCR259中，经PCR扩增出大小为1 605 bp的片段，与预期大小相符。将其质粒酶切后出现大小分别约为4 488 bp和1 605 bp的片段（图3）。将质粒送往北京英骏生物技术公司测序后证实，已成功构建了重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3。
注：M1.DL2 000 DNA Marker;M2.DL15 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因的PCR结果;2.重组质粒pCR259-VP3的Xhol、Sal I双酶切结果。
图3 重组质粒pCR259-VP3的鉴定
2.3 重组腺病毒rAd-VP3的制备及毒价测定
利用大量质粒提取试剂盒提取质粒，经过Pac I线性化酶切、无水乙醇沉淀后，由Lipofecta mine2000介导转染至QBI-HEK293细胞中，第8天开始细胞出现皱缩变圆、呈葡萄串状、逐渐脱落等细胞病变（图4），收获病毒，即为f0代重组腺病毒rAd-VP3。收获的f0代重组腺病毒rAd-VP3盲传至F6代，经Reed-Meunch方法计算rAd-VP3病毒滴度为109.15TCID50/ml。
注：A.重组腺病毒rAd-VP3导致QBI-HEK293细胞出现病变;B.正常QBI-HEK293细胞对照。
图4 QBI-HEK 293细胞的病变
2.4 rAd-VP3的RT-PCR鉴定
感染rAd-VP3的QBI-HEK293细胞，经RT-PCR扩增，f0、f2、f6、f10、f12代均可见1 605 bp特异目的条带，而空白对照组无特异条带（图5），表明rAd-VP3能稳定转录。
注：M.DL2 000 DNA Marker;F0、 F2、F6、F10、F12：RT-PCR扩增GPV-VP3基因转录结果;F：空白对照。
图5 重组腺病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK 293细胞的RT-PCR鉴定
2.5 IFA检测重组VP3蛋白在QBI-HEK 293细胞中的表达
经IFA检测，在荧光显微镜下，接种f0代重组原病毒rAd-VP3的视野下有特异绿色荧光出现，而空白对照组的视野下没有绿色荧光（图6），说明f0代重组原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293细胞中表达GPV-VP3蛋白。
2.6 Western blot 分析
经Western blot检测，在f0代重组原病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK293细胞裂解物中检测到分子量为60 Ku的特异性条带（图7），而空白对照组未见条带。结果表明，f0代重组原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293细胞中表达GPV-VP3蛋白。
3 讨论
目前，随着市场对鹅绒需求量的提升，养鹅业得到了迅
注：A.rAd-VP3在QBI-HEK293细胞中表达GPV-VP3蛋白;B.空白对照。
图6 IFA检测重组VP3蛋白在QBI-HEK 293细胞中的表达
注：M.蛋白质标准Marker;1.空白对照;2.rAd-VP3在QBI-HEK293细胞中表达GPV-VP3蛋白。
图7 Western blot检测重组VP3蛋白在QBI-HEK293细胞中的表达
猛发展。但是，随着集约化和规模化养殖的发展以及流通速度加快，使鹅细小病毒病在我国不同地区出现暴发和流行，表现为大批雏鹅突然死亡，有的病死率高达100%[4]。由于该病主要发生于雏鹅群体，病程短，传播速度快，死亡率高，使鹅细小病毒病成为危害我国养鹅业健康发展的最重要传染病之一，给养鹅业造成了巨大的经济损失[4-5]。近些年，由于地域的优势，延边地区向韩国和日本的鹅绒出口量在稳步上升，该地区对鹅绒的需求量也在上升，这就催生了养鹅业的快速发展，但随着鹅细小病毒病的发生和流行，严重制约了该地区养鹅业的健康发展，应该研制出一种安全、有效的疫苗进行免疫接种，遏制鹅细小病毒病的传播和蔓延。
从20世纪70年代中期开始，分子生物学技术迅速发展，使从事疫苗研究的科学家得以从分子水平对病原体的基因进行克隆和表达，用重组DNA技术研制的新型基因工程疫苗除了能保证其同传统疫苗具有同样的免疫原性外，最大的优越性是安全性高和经济效益好，避免了传统疫苗毒力返强、灭活不彻底等潜在危险，同时也具有易于区分免疫和自然感染的优点。在鹅细小病毒病结构蛋白（VP1、VP2、VP3）中，衣壳蛋白VP3是病毒的主要结构蛋白，约占总衣壳蛋白含量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激机体产生保护性中和抗体的重要抗原蛋白，所以VP3基因是研制基因工程疫苗的首选基因[6]。车茜等[7]通过基因枪轰击，将VP3基因疫苗（pcDNAGPV-VP3）接种免疫雏鹅，所诱导细胞免疫和体液免疫的能力明显强于弱毒疫苗。许洪洁等[8]将真核表达质粒（pVAXI-GPV-VP3）免疫小鼠，发现真核表达载体疫苗可诱导小鼠产生明显的体液免疫，但细胞免疫水平不显著。卢菲等[9]对GPV-VP3基因疫苗与弱毒疫苗进行了比较研究，对于GPV-VP3基因疫苗的免疫效力有不同的评价结果。高旭等[10]构建了包含GPV-VP3基因的VP2基因工程亚单位疫苗，免疫实验动物后可产生较高的抗体水平，短期免疫效果明显，但不能持久产生抗体，不能诱导持久的体液免疫和细胞免疫水平，这是不能回避的关键问题。活载体疫苗解决了此难题，活病毒载体不仅失去了致病性，而且还能在免疫机体内持续表达外源保护性抗原基因，兼有灭活疫苗和活疫苗的优点。在诸多的活病毒载体中，经过改造后的腺病毒安全性高、毒性低、宿主范围广，能同时诱导机体产生B细胞免疫和T细胞免疫反应，已成为目前最有应用前景的疫苗载体之一，被广泛应用于各种预防性或治疗性疫苗的研发，如HIV、流感、乙肝、狂犬病等疾病的腺病毒载体疫苗，并取得了可喜的效果[3]。但关于腺病毒载体用于鹅细小病毒方面的研究尚未见报道，所以这方面的研究与开发将有很大的空间和前景。
该研究以前期分离的YBLJ株GPV强毒[11]为毒种，克隆能产生中和抗体的VP3基因，所构建的腺病毒载体疫苗具有显著的地域性和针对性，对预防延边地区鹅细小病毒病发生和净化鹅细小病毒将具有重要意义。经试验发现，虽然GPV-VP3基因较长（1 605 bp），但在Lipofecta mine2000的介导下线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3蛋白，通过IFA和Western blot检测，蛋白表达量较高，再次证实GPV-VP3腺病毒载体疫苗研制的可行性，随着下一步体内免疫试验的开展，将验证该活载体疫苗的免疫效力和免疫机制，为GPV新型疫苗研发以及探讨腺病毒载体应用于鹅细小病毒病预防的前景奠定基础，进一步促进养鹅业的健康发展。
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