摘要：为了得到巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）发酵的最佳培养基，在单因子试验的基础上，应用Plackett-Burman设计法对影响芽孢产量的基本培养基组分中的关键因子进行了筛选，并进一步采用响应面分析法（RSM）对影响芽孢产量的关键因素最佳水平作了深入的研究。结果表明，影响巨大芽孢杆菌芽孢产量的关键因素是豆粕和淀粉的浓度。通过RSM的拟合和推算得到在豆粕和淀粉浓度分别为48.85和19.67 g/L时，此时模型预测发酵最佳产量为43.16×108 CFU/mL，验证值为42.2×108 CFU/mL，预测值与验证值之间吻合较好，比原始培养基提高了约10倍。
关键词：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；Plackett-Burman设计法；响应面分析法（RSM）
中图分类号：Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3539-03
Optimizing Fermentation Conditions of Bacillus megaterium
RAO Ben1，WANG Ya-ping2， LI Na3， ZHOU Rong-hua1，LIAO Xian-qing1，LIU Fang1，CHEN Wei1，ZHANG Guang-yang1，YANG Zi-wen1
（1.Biological Pesticide Engineering Research Center，Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China；2.Key Lab of Industrial Biotechnology， Hubei University， Wuhan 430062，China；3. Department of Life Science and technology/Yunan Provincial Key lab of Crop Quality and Efficient Cultivation and Safety Control， Red River Insitute，Mengzi 661100，Yunan，China ）
Abstract： To obtain the optimal medium for producing Bacillus megaterium spore， statistical method was used to investigate the medium components for spore concentration and productivity by Bacillus megaterium. The Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six variables. The results showed that the optimal values of the two parameters determined by RSM were soya bean meal of 48.85 g/L and starch of 19.67 g/L. The spore production was predicted to be 43.16×108 CFU/mL， and the actual value was 42.2×108 CFU/mL. They were fitted well with 10 folds increase.
Key words： Bacillus megaterium； Plackett-Burman； response surface analysis methodology （RSM）
收稿日期：2013-11-05
基金项目：国家科技支撑计划项目（2011BAD40B01）；湖北省农业科技创新中心项目（2013NKYJJ21）
作者简介：饶 犇（1983-），男，湖北孝感人，助理研究员，博士，主要从事发酵工程方面的研究，（电话）15623076968（电子信箱）
623253512@qq.com。
农业生产长期过分依赖化学肥料和农药，已经造成了农田土质和肥力下降，农作物品质降低，食品和地下水等环境污染也日趋严重。随着生态农业和绿色食品生产的兴起和发展，加之我国大多数土壤中速效磷、钾及其他一些养分的缺乏，微生物肥料作为生物技术发展和农业生产的一类重要肥源引起人们的重视。微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制品，将它应用于农业生产中，能够获得特定的肥料供应。
磷是植物三大营养元素之一，土壤含磷较多，能被植物直接利用的却极少，绝大部分是以不溶性的无机磷或植物不能利用的有机磷形式存在。微生物通过产酸或产酶等作用可使这些无效形式的磷化物转变为植物可利用的养料。土壤中约半数的微生物可分解有机磷，其中应用较多的是巨大芽孢杆菌[1-6]。
巨大芽孢杆菌可以用来生产解磷肥，具有很好的降解土壤中有机磷的功效，是生产生物有机肥的常用菌种，也是制作水体处理剂的常用菌种。为此，探索其培养条件和发酵工艺，可为工业化发酵生产奠定基础。
本研究以实验室自行分离得到的巨大芽孢杆菌NRJD20121菌株为研究对象，对其培养基和培养条件进行Plackett-Burman试验，筛选出显著的影响因子，然后通过响应面试验组合设计，拟合出数学模型方程，从而找到最优条件组合，并对其试验结果进行评估，以期初步筛选出比较合适的培养基配方。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种 由实验室自行分离，经鉴定为芽孢杆菌属中的Bacillus megaterium，编号为NRJD20121。
1.1.2 培养基 固体培养基为LB培养基。种子培养基配方（g/L）：淀粉16，酵母抽提物4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5；pH 7.0。发酵培养基配方（g/L）：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5。后期采用优化后的配方。
1.2 试验方法
1.2.1 发酵培养条件 接种体积分数为5%，发酵温度为30 ℃，摇床转速为200 r/min，发酵48 h。
1.2.2 Plackett-Burman试验 采用Minitab的Plackett-Burman两水平法对培养基成分进行考察，筛选影响生物量和芽孢产量的重要因素，确定最佳配方。以可溶性淀粉为碳源，以豆粕为氮源，设置豆粕浓度为X1、KH2PO4为X2、Na2HPO4为X3、淀粉为X4、CaCO3为X5、MgSO4为X6、MnSO4为X7（表1）。
1.2.3 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验得出的拟合方程安排最陡爬坡试验来确定因素取值中心点。拟合方程中各变量系数确定爬坡方向和变化步长，步长确定和试验条件相关。
1.2.4 中心组合设计和响应面分析 对Plackett-Burman试验确定的因素，以最陡爬坡试验得到的中心点。根据中心组合设计结果来拟合数据，得到描述响应值和自变量之间关系的二阶模型，即：
Y=b0+biXj+bijXiXj+biiXi2+e
其中，Y是产物能力测量值，b0是b截距，bi是关键因素线性效果的系数，bii是关键因素的二次效应的系数，bij是关键因素间交互作用的系数，Xi、Xj分别为各因子变量。
根据拟合的数学模型以及方差分析的结果，可以评价每个因子及其交互作用对过程的影响程度，利用响应面图和等高线图直观地描绘其结果，同时利用拟合的数学方程求解最优的结果。
1.2.5 培养基优化结果验证试验 用优化后的培养基组分配制发酵培养基，以5%接种量接入装液量为20 mL的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min条件下培养30 h。发酵结束后测定发酵液中的芽孢量。
1.2.5 生物量和芽孢数测定 活菌数按常规平板计数法测定[7]，检测芽孢数前，将菌液在80 ℃预处理20 min，再按照常规平板计数法测定[8，9]。
2 结果和讨论
2.1 Plackett-Burman试验各因素参数的t-检验分析结果
Plackett-Burman试验各因素参数的t-检验分析结果见表2。由表2可知，淀粉和豆粕对巨大芽孢杆菌的生长和芽孢形成有显著影响，可信度在95%以上。且两者对芽孢形成的影响是正效应。
2.2 最陡爬坡试验
最陡爬坡试验设计与结果见表3。由表3可得如下回归方程：
Y=30.25+3.583 3X1+0.583 3X2-0.250 0X3+1.083 3X4-0.583 3X5+0.750 0X6-0.583 3X7
该方程拟合的R2=0.967 4，此多项式方程能很好地模拟和解释Plackett-Burman的试验结果。
2.3 中心组合设计试验
根据Plackett-Burman试验可知，影响巨大芽孢杆菌芽孢产量的两个重要因素分别是可溶性淀粉和豆粕。根据中心优化组合方法，设计了2因素5水平的响应面分析，试验设计见表4。由表4可知，开始时巨大芽孢杆菌芽孢产量随着豆粕与淀粉浓度的升高而增加，在步移进行至第三步时达到最高点，之后巨大芽孢杆菌芽孢产量开始下降。步移最高点时豆粕与淀粉的浓度分别为45 g/L和21 g/L，此点被用作下一步响应面分析的中心点。
以可溶性淀粉和豆粕为自变量，以巨大芽孢杆菌的芽孢数为响应值，根据分析结果得到的二次多项式回归方程为：
Y=-676.546+9.442 65X1+49.778 7X2-0.079 74X12
-1.163 9X22-0.083 333X1X2
其中，Y为响应值，X1为豆粕浓度，X2为淀粉浓度。
回归方程各项方差分析表明，方程一次项和二次项X1和X2的P值均小于0.05，说明影响显著。失拟项P=0.464>0.1，无失拟现象。回归方程的R2=0.997 4，调整值为0.995 5，说明回归方程对试验结果具有较好的拟合能力。
利用Minitab软件对回归模型进行响应面分析，考察所拟合响应面的形状，得到各响应面立体分析图和相应等高图，见图1和图2。软件分析可知该模型具有最大值，利用Minitab软件响应优化器进行计算可得，最大值处X1=48.85 g/L，X2=19.67 g/L，在此条件下理论预测得到的值为43.16×108 CFU/mL。
2.4 最佳培养基的验证
为了确定试验结果的可靠性，对上述优化条件进行了验证试验，共做了3组平行试验，结果测得巨大芽孢杆菌的芽孢数为42.2×108 CFU/mL，与预测值十分接近。
3 小结与讨论
对巨大芽孢杆菌产芽孢培养基进行了优化研究，得到最佳培养基配方（g/mL）：淀粉19.67、豆粕48.85、KH2PO4 2、Na2HPO4 0.5、CaCO3 0.5、MgSO4 0.5、MnSO4 0.5，在此条件下，巨大芽孢杆菌生成芽孢的理论最高产量为43.16×108 CFU/mL，验证试验中最高值为42.2×108 CFU/mL，与理论预测相符，与优化前相比产量提高了10倍。
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